王海娟,王 利
(1.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都610041;2.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都610041)
溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)屬弧菌科、氣單胞菌屬,是一種人、魚和其他動物共患的條件性致病菌,可引起人類患細菌性腹膜炎、菌血癥、軟組織壞死、急性腸胃炎、闌尾炎、壞死性筋膜炎等疾病[1-3],同時也可感染多種魚類。目前已從鱸魚、日本鰻鱺、羅非魚、中華鱉[4]、黃顙魚等分離鑒定出該菌。溫和氣單胞菌致病株的毒力與其產(chǎn)生的溶血素、腸毒素、細胞毒素及胞外酶等多種重要的致病因子有關。當條件適宜時,該菌生長迅速,繁殖較快,其產(chǎn)生的毒素可引起機體復雜多樣的病理變化。
鯽魚(Cruciancarp)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見淡水魚類。近年來,隨著水體惡化、養(yǎng)殖集約化等現(xiàn)象,細菌性疾病屢次發(fā)生,對鯽魚及整個水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失,對人類的健康構成了潛在的威脅。弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[5]、遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)、沙門菌(Salmonella)等相繼從發(fā)病鯽魚體內分離出,但尚未見溫和氣單胞菌對鯽魚致病性研究的報道。本試驗采用PCR方法對溫和氣單胞菌菌株A.S1進行毒力基因檢測,同時人工回歸感染鯽魚,旨在為進一步研究溫和氣單胞菌在魚類中的致病機制提供科學資料。
1.1.1 試驗菌株 溫和氣單胞菌菌株A.S1由本校動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 主要試劑及儀器 普通營養(yǎng)瓊脂,杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品;DNA Marker D L 2 000,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;細菌基因組DNA提取試劑盒和2×TaqPCR MasterMix,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;PCR儀,Eppendorf公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng),Bio-Rad公司產(chǎn)品。
1.2.1 制備DNA模板 將超低溫保存的溫和氣單胞菌菌株快速復蘇,接種于LB液體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)過夜,簡短離心,采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌的總DNA,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 引物設計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的毒力基因序列,利用Primer 5.0軟件設計溫和氣單胞菌4種主要毒力因子溶血素基因(hly)、細胞興奮性腸毒素基因(alt)、黏附素基因(aha1)和氣溶素基因(aerA)的引物。引物序列見表1,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.2.3 毒力基因擴增 采用PCR方法對4種主要毒力基因進行擴增,反應體系(20μL):ddH2O 7.4μL,上、下游引物各 0.8μL(引物濃度均為10μmol/L),2×TaqMix 10μL,DNA 模板1μL。PCR反應程序:94℃3min;94℃30s,53s~60s(退火溫度見表1),72℃60s,35個循環(huán);最后72℃10min。取PCR產(chǎn)物5μL進行10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,并在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。
表1 溫和氣單胞菌毒力基因的引物序列Table 1 Primer sequences of virulence genes of Aeromonas sobria
1.2.4 動物回歸試驗 將復蘇后的溫和氣單胞菌于LB液體培養(yǎng)基中,28℃、180r/min培養(yǎng)過夜,簡短離心,除去上層多余液體培養(yǎng)基。參考麥氏比濁法,用7.5g/L的滅菌生理鹽水將該菌配置成濃度為1.5×108CFU/mL的菌懸液。將20條健康的鯽魚分為對照組和試驗組,每組分配10條,體長15cm~17cm,體重120g~150g。對照組每尾鯽魚注射0.3mL的無菌生理鹽水,試驗組的每尾鯽魚腹腔注射等體積的菌懸液。每日觀察試驗組鯽魚的癥狀并記錄死亡情況,連續(xù)觀察1周。及時對死亡鯽魚進行剖檢,無菌條件下將其心、肝、脾等組織劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。應用傳統(tǒng)的細菌鑒定方法和擴增16SrDNA基因方法鑒定再次分離到的細菌。
溫和氣單胞菌的4種主要毒力基因擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測結果如圖1所示,該菌株中擴增到hly、alt和aha1 3種毒力基因,擴增片段的長度分別為1 470、480、1 087bp,與預期片段長度基本相符。未擴增出aerA基因。
將健康鯽魚腹腔注射溫和氣單胞菌菌懸液后,均在2d~5d發(fā)病死亡。發(fā)病鯽魚初期表現(xiàn)為行動緩慢,對外界刺激反應遲鈍,眼周、下頜及鰭條基部輕微出血,鰓蓋周圍點狀出血。嚴重時魚體在水中失去平衡,體表大面積出血,且胸鰭、腹鰭和臀鰭出血加重,腹部腫大。解剖后發(fā)現(xiàn),部分魚體腹腔有腹水,腸道充盈,肝臟質地較脆,脾臟暗紅色。對照組的鯽魚在試驗期間無發(fā)病及死亡情況。從人工回歸感染溫和氣單胞菌后的瀕死鯽魚的脾、肝和心組織中分離到形態(tài)與自然感染菌株一樣的細菌,該菌的16SrDNA基因比對結果顯示為溫和氣單胞菌。
圖1 菌株A.S1的毒力基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of virulence genes of strain A.S1
氣單胞菌的致病機制是復雜的,是由多種毒力因子如腸毒素、溶血素、鞭毛A和B(fla)、脂肪酶(lip)、彈性蛋白酶(ela)、絲氨酸蛋白酶(ser)、ADP-轉移酶毒素(aexT)等相互作用的結果。檢測氣單胞菌屬的毒力基因對確定病原體潛在的致病性和后續(xù)可能的感染病原體的預防是至關重要的。
溫和氣單胞菌的溶血素對哺乳動物細胞都具有細胞毒性和腸毒性。溶血素腸毒性作用的機制是可刺激培養(yǎng)的動物細胞產(chǎn)生環(huán)腺苷酸。研究表明,溫和氣單胞菌的hly基因與嗜水氣單胞菌的氣溶素基因在氨基末端區(qū)域的序列是同源的,但在羧基端沒有同源性。程方俊等[6]從溫和氣單胞菌RC-07-KA菌株克隆擴增出hly基因,并構建了重組溶血素及檢測其活性。hly基因已從人源溫和氣單胞菌檢測到,本研究從魚源菌株A.S1中也檢測到了hly基因,這說明溶血素基因在多種不同來源的溫和氣單胞菌中存在。腸毒素包括細胞興奮性腸毒素、細胞毒腸毒素和細胞溶解性腸毒素。腸毒素前體是由488個氨基酸殘基合成,成熟的腸毒素其氨基末端的24個氨基酸殘基前體被移除。這些與抗原性相關的毒素被認為在誘發(fā)機體腹瀉中起著關鍵作用。細胞興奮性腸毒素可引起小鼠腸道液體的積累,但不會造成細胞損傷[7]。另外,溫和氣單胞菌腸毒素可使中國倉鼠卵巢細胞(CHO)誘導細胞內乳糖脫氫酶(LDH)的釋放,當增加葡聚糖時可抑制LDH的釋放和毒素對紅細胞的溶解作用。毒素可在紅細胞膜上形成膜孔,進而形成滲透梯度造成紅細胞損傷。這與嗜水氣單胞菌的腸毒素致病機制很類似。Pablos M等[8]從分離自腹瀉患者和飲用水的800株氣單胞菌中,檢出毒力基因alt、hlyA、aerA、ast、laf攜帶率分別為 71.9%、28.1%、25.0%、18.8% 和9.4%。本研究中檢測到alt基因,這說明alt基因廣泛存在氣單胞菌屬中。
關于黏附素基因(aha1)報道的較少,在5株黃沙鱉源嗜水氣單胞菌中,毒力基因hly、aerA和act的檢測率為100%,ahal、alt和ahp 為80%[9]。13株致病性氣單胞菌中10株細菌同時攜帶毒力基因alt,ahal和aerA[10]。本試驗菌株 A.S1中檢測出ahal基因。氣溶素aerA的致病機制是,其成熟蛋白可與宿主細胞表面的特異性糖蛋白受體相結合,植入脂質雙分子層,形成膜孔,破壞細胞的通透性,導致宿主細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn),86株意大利氣單胞菌菌株(30%嗜水氣單胞菌、18.5%豚鼠氣單胞菌、23.7%殺鮭氣單胞菌)中83.7%菌株攜帶aerA基因[11]。109株墨西哥和西班牙人源氣單胞菌菌株中,檢測到攜帶aerA基因的菌株占89%[12]。本研究中沒有檢測到aerA基因,說明aerA毒力基因的分布是多樣性的,在不同宿主、不同地域和不同菌株間是存在差異的。
溫和氣單胞菌在河水和海水中也可以產(chǎn)生毒素,這說明自然界的溫和氣單胞菌的毒素可能會通過水體,食物源等途徑傳遞到人和動物體,從而導致人和動物體發(fā)病。關于溫和氣單胞菌的致病性已有部分研究。童桂香等[13]研究表明,溫和氣單胞菌對黃沙鱉具有較強的致病性,在人工感染30h后出現(xiàn)死亡。任紅梅等[14]發(fā)現(xiàn),黃鱔在感染溫和氣單胞菌3h左右,其內臟器官發(fā)生病變,12h~36h出現(xiàn)死亡高峰期。馬有智等[15]將溫和氣單胞菌分別感染小鼠和中華鱉發(fā)現(xiàn),小鼠在感染24h內全部死亡,健康鱉在感染6d~8d發(fā)病,17d出現(xiàn)死亡。本試驗將溫和氣單胞菌感染鯽魚后發(fā)現(xiàn),健康鯽魚在48h后出現(xiàn)發(fā)病癥狀,第3天出現(xiàn)死亡,這說明溫和氣單胞菌對鯽魚具有較強的致病性。因此,在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中,應加強水質管理,同時采取積極的措施預防該病的發(fā)生。
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