熊 勇，趙春艷，楊青松，王錦琳

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500；2.昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221)

燈盞花ITS2基因克隆及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

熊 勇1，趙春艷2，楊青松1，王錦琳1

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500；2.昆明食用菌研究所,云南 昆明 650221)

利用PCR方法擴(kuò)增燈盞花ITS2基因并克隆，獲得ITS2基因序列.用生物軟件對(duì)ITS2序列進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，得到燈盞花的ITS2核苷酸序列為205 bp，基于ITS序列飛蓬屬11種共分為5支，分支與地理分布情況基本一致.ITS2 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在飛蓬屬種間表現(xiàn)基本一致，而TS2區(qū)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出屬間差異.利用rDNA ITS區(qū)序列一結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)相結(jié)合達(dá)到鑒定藥用植物燈盞花分類的目的.

燈盞花；基因克??；ITS2；系統(tǒng)樹；RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

燈盞花學(xué)名為短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz,為菊科(Composttiae)紫苑族(Trib.AstereaeCass.)飛蓬屬(Ergeiorn)多年生草本植物，主要產(chǎn)于我國(guó)云南、貴州、四川等省，其中95%以上的野生資源分布于云南[1]，作為傳統(tǒng)民族藥，在云南少數(shù)民族苗族和白族地區(qū)的運(yùn)用已有600多年歷史[2].從20世紀(jì)70年代開始，以燈盞花總黃酮為原料的燈盞花制劑廣泛應(yīng)用于臨床，具有多種療效且療效好、安全性高，尤其是在治療心腦血管疾病方面，其總有效率達(dá)88.3%[3-4]，目前野生資源日益減少[5].為解決燈盞花藥材的資源短缺，在云南省很多地州燈盞花已經(jīng)大面積種植并推廣[6]，對(duì)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展起到重要的作用.由于燈盞花野生種值資源長(zhǎng)期的自然選擇和生境的改變，以及栽培品種經(jīng)過長(zhǎng)期的人工雜交選育等原因，導(dǎo)致部分基因流失[7]，栽培品種的遺傳多樣性豐富度在降低，因此利用有效的DNA分子方法對(duì)該藥用植物的鑒定具有重要的作用.DNA分子鑒定技術(shù)擁有傳統(tǒng)鑒定不可比擬的一些優(yōu)勢(shì)，已成功運(yùn)用于多種中藥材鑒定[8]，其中核糖體DNA第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS2)序列長(zhǎng)度小于 300 bp，適合進(jìn)行各種分子操作，而且變異較快，能夠提供較豐富的信息位點(diǎn)，已在藥用植物鑒別系統(tǒng)發(fā)育和分類研究中發(fā)揮重要作用[9].本文以云南燈盞花為材料，對(duì)其rDNA ITS2序列進(jìn)行了克隆及序列測(cè)定，并將其與相關(guān)植物的序列進(jìn)行比較分析，以此來鑒定藥用植物燈盞花，同時(shí)為我國(guó)藥材市場(chǎng)安全提供保障.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

供試燈盞花來自云南省劍川縣沙溪鎮(zhèn)，實(shí)驗(yàn)室栽種，新鮮燈盞花植物葉片作為材料.

1.1.2 試劑

2×PCR Master mix，DNA MarKer，PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒，質(zhì)粒puM-T，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，上述試劑及試劑盒均購(gòu)于北京泰克生物技術(shù)有限公司.

1.1.3 引物

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物[9]，設(shè)計(jì)引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，燈盞花rDNA ITS2區(qū)域的引物的序列如表1：

表1 設(shè)計(jì)的引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 燈盞花總DNA的提取

燈盞花總DNA提取方法參照SDS法[10]，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量.

1.2.2 燈盞花的ITS2基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppedorf PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積50 μL：25 μL 2×Mixture，引物2R和引物2F各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL.

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32次循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，最后4 ℃保存.擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果.

1.2.3 燈盞花ITS2基因克隆

取PCR產(chǎn)物于1.5%膠進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，進(jìn)行膠回收.將回收的DNA片段連接到puM-T載體上，于16 ℃反應(yīng)3 h；將連接后的puM-T載體轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)宿主中培養(yǎng)；再將菌液涂布在含有X-gal底物、IPTG誘導(dǎo)物和氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基平板中，利用藍(lán)白斑遺傳學(xué)篩選法篩選；挑選白色單一菌落，LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過PCR法轉(zhuǎn)化子鑒定，將重組質(zhì)粒送到生物公司進(jìn)行測(cè)序.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

用生物軟件DNAMAN對(duì)正向、反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得燈盞花ITS2基因一致序列，并在NCBI上進(jìn)行同源性比較，查看克隆結(jié)果的可靠性，去除5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列.用Mega 6.0[11]中的 Kimura-2-parameter 模型計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建距離矩陣.以菊科飛蓬屬Erigeron為聚類基礎(chǔ)，用鄰接 (neighbor-joining method，N-J) 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，再用DNAstar[12]、ClassyTK1.0、RnaViz2.0[13]等繪制RNA二級(jí)結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與分析

2.1 燈盞花ITS2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

燈盞花不同居群ITS2基因PCR擴(kuò)增序列長(zhǎng)度約在250～500 bp之間，PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)清晰明顯條帶(圖1).

2.2 測(cè)序結(jié)果分析

用DNAMAN對(duì)正向、反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得燈盞花ITS2基因一致序列，使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列205 bp，燈盞花ITS2基因序列如圖2.

2.3 遺傳距離

以自測(cè)的燈盞花Erigeronbreviscapu為探針，在NCBI庫(kù)進(jìn)行blast獲得飛蓬屬11個(gè)種，利用生物軟件Mega6.0中Kimura 2-parameter model分析飛蓬屬基于ITS2序列的種間遺傳距離并構(gòu)建距離矩陣(表2).飛蓬屬種間的遺傳距離為0.000～0.051，Erigeronkarvinskianus[14]與其他種的遺傳距離均較大為 0.036～0.051;本研究獲得的燈盞花ITS2序列與NCBI庫(kù)中Erigeronbreviscapus(GU213433)遺傳距離最近，而與加勒比飛蓬Erigeronkarvinskianus最遠(yuǎn)，與地理分布距離一致.

表2 飛蓬屬種間的遺傳距離

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將飛蓬屬的11個(gè)物種進(jìn)行序列對(duì)比，并采用Mega軟件構(gòu)建其N-J系統(tǒng)發(fā)育樹圖3(黑體為本研究獲得的燈盞花ITS2序列).系統(tǒng)發(fā)育樹共分成5支，Erigeronmorrisonensis、Erigeronborealis、Erigeronacris與Erigeronunifloru先聚在一起，然后再與Erigeronbreviscapus聚類，作為整個(gè)進(jìn)化樹的核心.實(shí)驗(yàn)所要研究的目的樣品Erigeronbreviscapus與GenBank庫(kù)中Erigeronbreviscapus(GU213433)聚在一起，說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，而Erigeronkarvinskianus[15]單獨(dú)聚在一起.燈盞花與飛蓬屬的其他物種有一定的差異，其他的物種聚在不同的分支，這可能與物種的地理分布有關(guān)系，如Erigeronbreviscapus(短葶飛蓬)主要生長(zhǎng)在云南、西藏；Erigeronmorrisonensisvar(玉山飛蓬)等分布在臺(tái)灣，Erigeronursinus(一年蓬)等分布在四川、西藏、安徽等??；Erigeronkarvinskianus(加勒比飛蓬)主要生長(zhǎng)在北美，而臺(tái)灣也有分布.每個(gè)分支的物種基本與地理分布相符合.

2.5 燈盞花ITS2基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用DNAstar中GenQuset、RnaViz2.0等軟件構(gòu)建本研究獲得的Erigeronbreviscapus、GeneBank下載的Erigeronkarvinskianus(AF118487)以及菊屬雛菊Bellisperennis(JX065158)[15]rDNA ITS2區(qū)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，并分析結(jié)構(gòu)上的差異，結(jié)果見圖4～6.

短葶飛蓬(燈盞花)Erigeronbreviscapus與加勒比飛蓬Erigeronkarvinskianus在一級(jí)結(jié)構(gòu)上具有一定的差異，基于ITS2核苷酸序列在11個(gè)飛蓬屬的種間距離也較遠(yuǎn)，但從從圖4～5 可以看出，Erigeronbreviscapus與Erigeronkarvinskianu預(yù)測(cè)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)得到的莖環(huán)數(shù)量一樣都是4，結(jié)構(gòu)也相似，而菊屬雛菊Bellis perennis ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)莖環(huán)數(shù)為5，結(jié)構(gòu)也相差較大，表現(xiàn)為種內(nèi)基本一致，屬間差異較大.

3 結(jié)果與討論

ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的核心區(qū)域具有高度的保守性，在研究物種的起源及高級(jí)階元的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系中起著很重要的作用[16].相對(duì)于DNA序列和氨基酸序列，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠提供結(jié)構(gòu)差異方面的信息，對(duì)于燈盞花的分子分類具有一定的參考價(jià)值，可以作為一種研究物種分子系統(tǒng)學(xué)的重要手段.本研究發(fā)現(xiàn)，飛蓬屬種間rDNA 的ITS2核苷酸序列具有一定的差異，表現(xiàn)出遺傳距離與地理分布項(xiàng)一致，但是構(gòu)建的rDNA 的ITS2 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在飛蓬屬種間基本一致，表現(xiàn)為在菊科不同屬間二級(jí)結(jié)構(gòu)有差異.

本研究所克隆測(cè)序的燈盞花ITS2序列長(zhǎng)度約為205bp，與GeneBank中的Erigeron breviscapus(GU213433)相比較沒有差異，結(jié)果正確.用Mega中Kimura 2-parameter model計(jì)算并構(gòu)建遺傳距離圖，以及用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，所分析的飛蓬屬11個(gè)種分為五支，加勒比飛蓬Erigeron karvinskianu與其他種遺傳距離較大，每個(gè)分支的物種基本與地理分布相符合，通過遺傳距離以及系統(tǒng)發(fā)育樹，可以為燈盞花的雜交育種提供一定的理論基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯 王 琳)

Cloning of ITS2 gene and analysis of its RNA secondary structural characteristics inErigeronbreviscapus

XIONG Yong1,ZHAO Chun-yan2,YANG Qing-song1,WANG Qing-lin1

(1.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education of China,Yunnan Minzu University,Kunming 650500,China; 2. Kunming Edible Fungi Institute,Kunming 650221,China)

The rDNA ITS2 region in theErigeronbreviscapuswas amplified by PCR and cloned,and its sequence was obtained. The biological software was used to analyze rDNA ITS2 sequence and modeled its RNA secondary structure and phylogenetic tree. The length of ITS sequence was 205 bp. The phylogenetic tree(N-J) showed 11Erigeronspecies clustered into 5 branches based on ITS2 gene sequences. The ITS homology ofErigeronwas consistent with that of geographic distribution. A comparison of the secondary structures of rDNA ITS2 sequences revealed that the different species inErigeronhad no diversity. The secondary structure of the ITS2 regions was quite different among these genus species. Nucleotide sequence combined with the secondary structure of rDNA ITS region may achieve some identification of the classification ofErigeronbreviscapus.

Erigeronbreviscapus; ITS2 gene cloning; Phylogenetic tree; RNA secondary structure

2014-11-24.

云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(MZY1116).

熊勇(1977-)，男，碩士，副教授.主要研究方向:生物化學(xué).

Q7

A

1672-8513(2015)02-0151-05