李洪偉，吳仲巋，楊家安，趙曉飛

（1.武漢理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430070；2.麥科羅醫(yī)藥科技有限公司，湖北武漢430075）

高通量篩選高特異性的檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物探針分子

李洪偉1，吳仲巋1，楊家安2，趙曉飛2

（1.武漢理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430070；2.麥科羅醫(yī)藥科技有限公司，湖北武漢430075）

從靶蛋白-配體特異性結(jié)合角度，采用蛋白折疊碼（PFSC）技術(shù)在PDB數(shù)據(jù)庫中高通量地篩選出與TNFA_HUMAN靶點(diǎn)區(qū)結(jié)合靈敏度高的分子作為檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物探針分子.結(jié)果顯示，小分子307具有相對(duì)較高的靈敏度和較低的檢出限，可以作為生物探針來檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎.結(jié)果顯示，蛋白指紋檢索技術(shù)是一種快速、有效的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢索工具，通過對(duì)數(shù)據(jù)庫中海量數(shù)據(jù)的篩選，可為重大疾病的檢測(cè)試劑開發(fā)提供先導(dǎo)信息.①

蛋白折疊形狀碼；高通量篩選；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；生物探針分子

0 引言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎R(shí)A是一種常見的以關(guān)節(jié)炎癥和滑膜細(xì)胞增殖為特征的全身性自身免疫性疾病，具有極高的致畸性［1-2］，臨床癥狀類似于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，但兩者病因病理相差巨大.傳統(tǒng)檢測(cè)RA的方法是檢測(cè)類風(fēng)濕因子RF水平，但存在大量漏診和誤診狀況［3-5］.有大量資料表明，在RA滑膜病變的發(fā)展過程中有多種炎性因子，其中巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-1、TNF-α在發(fā)病過程中起主導(dǎo)作用，病患血液和炎性滑液中IL-1、TNF-α明顯高于健康人群，且隨疾病的活動(dòng)度增高而升高，二者相互協(xié)同［6-9］.因此，我們可通過檢測(cè)其中之一來診斷RA，本研究中以TNF-α為例.

目前，基于靶點(diǎn)蛋白的藥物因具有高特異性和高敏感度成為當(dāng)今藥物開發(fā)的研究熱點(diǎn)，TNFA_HUMAN是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要治療靶蛋標(biāo)［10］，本研究中從蛋白質(zhì)-配體高特異性結(jié)合的角度，擬從與靶蛋白相互作用的小分子配位體的角度來檢測(cè)目標(biāo)靶蛋白.目前，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）已經(jīng)積累了大量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，庫中除了含有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)外，還包括將近兩萬小分子配位體.如何從海量已知數(shù)據(jù)庫中篩選針對(duì)特定蛋白靶標(biāo)的配位體是非常困難的，在蛋白折疊形狀碼（PFSC）基礎(chǔ)上發(fā)展的蛋白指紋檢索技術(shù)可以對(duì)數(shù)以萬計(jì)的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速有效檢索［11-13］.因此本研究中采用PFSC技術(shù)從配位體分子角度高通量地篩選出與TNFA_HUMAN靶點(diǎn)區(qū)結(jié)合敏感度高的分子，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測(cè)試劑的開發(fā)提供先導(dǎo)信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 數(shù)據(jù)來源TNF-α是由白血球產(chǎn)生具有抗腫瘤作用而導(dǎo)致炎癥的細(xì)胞因子，TNF-α拮抗劑是控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情發(fā)展的有效藥物［10］，因此，本研究中從治療RA的靶點(diǎn)-配體分子的角度篩選配體分子.首先，從PDB中提取有關(guān)TNF-α的pdb晶體結(jié)構(gòu)，共14個(gè)，分別是1A8M，1TNF，2AZ5，2E7A，2TUN，2ZJC，2ZPX，3ALQ，3IT8，3L9J，3WD5，4G3Y，4TSV，5TSW.我們以DrugBank數(shù)據(jù)庫發(fā)布的信息，找出其中能與小分子配位體作用的TNF-α蛋白結(jié)構(gòu)，它們分別是3ALQ，3L9J，2AZ5，2ZJC和3IT8，其中3ALQ與3L9J是金屬配體，特異結(jié)合性較差，故范圍縮小至2AZ5、2ZJC與3IT8 3種.

理想的探針分子應(yīng)該具有較高的選擇性，但小分子通常會(huì)作用于多個(gè)靶點(diǎn)蛋白，所以需要在全部的PDB數(shù)據(jù)庫中檢索出與小分子配體和TNFA_HUMAN作用相似的蛋白并進(jìn)行打分排序，從中篩選出對(duì)TNFA_HUMAN兼具高特異性高敏感度的小分子用作類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測(cè)試劑的開發(fā).

表1 可與小分子配位體相互作用的蛋白結(jié)構(gòu)

1.2 方法

1.2.1 蛋白三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成一維PFSC碼蛋白形狀折疊碼（PFSC）技術(shù)是采用27個(gè)向量（包括26個(gè)英文字母和一個(gè)符號(hào)$）表示的描述蛋白質(zhì)碳骨架從氨基端到碳基端的三維結(jié)構(gòu)的方法，它可以將一個(gè)具有確定三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)全部或部分的轉(zhuǎn)化為一維指紋結(jié)構(gòu)的編碼，并且可以精細(xì)區(qū)分出相似三維結(jié)構(gòu)及功能［12-13］.通過PFSC程序?qū)⑷縋DB數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)（截止到2015年1月15日，共106 082個(gè)）下載并轉(zhuǎn)化成一維指紋數(shù)據(jù)庫，以便高通量檢索提取有用信息.

1.2.2 分子作用模擬Accelrys Discovery Studio（DS）是基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)模擬、優(yōu)化和藥物設(shè)計(jì)工具.分別模擬出2AZ5、2ZJC與3IT8 3種蛋白質(zhì)與其小分子配體相互作用模型，觀察pdb文件中配體與蛋白質(zhì)作用位置（即活性位點(diǎn)）以幫助定義目標(biāo)靶點(diǎn)區(qū).

圖1 2AZ5與配體相互作用構(gòu)象的側(cè)面視圖（A）和俯視圖（B）

圖2 2ZJC與配體相互作用構(gòu)象的側(cè)面視圖（A）和俯視圖（B）

圖3 3IT8與配體相互作用構(gòu)象的側(cè)面視圖（A）和俯視圖（B）

1.2.3 TNFA靶點(diǎn)區(qū)定義設(shè)置PFSC程序檢索條件值，結(jié)合Discovery Studio模擬中與配體較強(qiáng)作用的活性位點(diǎn)定義檢測(cè)靶點(diǎn)片段，通過PFSC程序先將蛋白靶點(diǎn)區(qū)結(jié)合位點(diǎn)片段的空間構(gòu)型轉(zhuǎn)換為一維指紋碼，對(duì)結(jié)合位點(diǎn)在PDB一維指紋碼數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行高通量的相似性搜索，擬發(fā)現(xiàn)具有類似結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu).

1.2.4 數(shù)據(jù)庫掃描及處理從TNFA_HUMAN靶點(diǎn)區(qū)出發(fā)，利用上述藥物蛋白靶點(diǎn)檢索技術(shù)分別掃描全部的蛋白指紋數(shù)據(jù)庫，通過比較蛋白指紋數(shù)據(jù)庫中蛋白-配體特異性結(jié)合位點(diǎn)與TNFA蛋白-配體結(jié)合位點(diǎn)的相似性進(jìn)行打分，打分系統(tǒng)由PFSC碼、關(guān)鍵殘基的物理化學(xué)性質(zhì)（PHCP-k）和全部殘基的物理化學(xué)性質(zhì)（PHCP-a）等組成，分?jǐn)?shù)進(jìn)行加權(quán)［13］，分值越高表示特異性結(jié)合程度越相似，將與同一蛋白作用的各片段分值導(dǎo)入Excel表格，根據(jù)加權(quán)分值降序排列，提取出特異性結(jié)合度高的排名前200的蛋白結(jié)構(gòu)添加Uniport信息，最終篩選出與TNFA_HUMAN靶蛋白作用相似性最大的小分子配體，可以用作開發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測(cè)試劑.

2 結(jié)果與討論

2.1 靶點(diǎn)區(qū)選取

2.1.1 2AZ5靶點(diǎn)區(qū)選取2AZ5共有4條多肽鏈與2個(gè)小分子配位體（307），結(jié)合Discovery Studio模擬結(jié)合位點(diǎn)圖示可以知道同側(cè)兩條鏈與同一個(gè)配體相互作用，整個(gè)模擬圖呈軸對(duì)稱，同側(cè)鏈（A鏈和C鏈）得到的靶點(diǎn)區(qū)也相似，本研究對(duì)與A鏈和C鏈作用的靶點(diǎn)區(qū)進(jìn)行分析，PFSC確定結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)如表2所示.

表2 2AZ5靶點(diǎn)區(qū)的氨基酸序列和PFSC編碼

表3 2JZC靶點(diǎn)區(qū)的氨基酸序列和PFSC編碼

表4 3IT8靶點(diǎn)區(qū)的氨基酸序列和PFSC編碼

2.1.2 2ZJC靶點(diǎn)區(qū)選取對(duì)于2ZJC結(jié)構(gòu)，Discovery Studio模擬結(jié)合位點(diǎn)顯示其三條鏈均與配位體GOL作用，PFSC確定的結(jié)合位點(diǎn)靶點(diǎn)區(qū)見表3.

2.1.3 3IT8靶點(diǎn)區(qū)選取3IT8共有12條鏈，其中D、E、F、J、K、L共6條鏈可以與小分子NAG作用，結(jié)合Discovery Studio模擬結(jié)合位點(diǎn)，每條鏈與NAG作用的位點(diǎn)也相似，因此選擇E鏈上的靶點(diǎn)區(qū)作為檢索靶點(diǎn)，PFSC確定的結(jié)合位點(diǎn)靶點(diǎn)區(qū)見表4.

2.2 相似性檢索的數(shù)據(jù)處理

2.2.1 2AZ5的數(shù)據(jù)分析在全部檢索結(jié)果中選出前200名受體蛋白，添加Uniprot信息.正文中選取了應(yīng)用PFSC碼在10萬蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中高通量篩選出的與2AZ5和小分子結(jié)合性相似度排名前20的蛋白質(zhì)，藥物蛋白靶點(diǎn)檢索結(jié)果顯示小分子307可以作用于TNFA_HUMAN、OMPX_ECOLI、PAGP_ECOLI等多種受體蛋白.在我們選取的排名前200蛋白中，除了集中作用于TNFA_HUMAN之外，還集中作用于包括OMP、BGAL、Q8WSF8和Q8RLA6等類別受體（表5）.同時(shí)，根據(jù)藥物蛋白靶點(diǎn)檢索相似性打分的結(jié)果顯示307小分子優(yōu)先且集中作用于TNFA_HUAMN族蛋白，說明小分子307對(duì)TNFA_HUMAN靶蛋白兼具特異結(jié)合性和較高的敏感度，因此可以將小分子307作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測(cè)試劑的潛在探針分子.

2.2.2 2JZC的數(shù)據(jù)分析正文中選取了應(yīng)用PFSC碼在10萬蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中高通量篩選出的與2JZC和小分子GOL結(jié)合度相似性排名前20的蛋白質(zhì)，藥物蛋白靶點(diǎn)檢索結(jié)果顯示小分子GOL可以集中且優(yōu)先作用于CARP_YEAST蛋白靶標(biāo).在我們選取的排名前200蛋白中，除了集中作用于CARP_YEAST之外，還集中作用于包括GSA_SYNE、AMPM_ECOLI、Q89ZB9_BACTN、B2 MG_HUMAN等類別受體（表6）.同時(shí)，根據(jù)藥物蛋白靶點(diǎn)檢索相似性打分的結(jié)果顯示小分子GOL對(duì)目標(biāo)蛋白TNFA_HUMAN只有特異結(jié)合性并無較高的敏感度，因此，不能將小分子GOL作為檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在探針分子.

表5 使用PFSC碼高通量篩選出與2AZ5和小分子307相似結(jié)合的排名前20的蛋白質(zhì)（10萬數(shù)據(jù)庫）

表6 高通量篩選出與2JZC和小分子GOL相似結(jié)合的排名前20的蛋白質(zhì)（10萬數(shù)據(jù)庫）

續(xù)表6

2.2.3 3IT8的數(shù)據(jù)分析正文中選取了應(yīng)用PFSC碼在10萬蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中高通量篩選出的與3IT8和小分子NAG結(jié)合性相似度排名前20的蛋白質(zhì)，藥物蛋白靶點(diǎn)檢索結(jié)果顯示小分子NAG可以優(yōu)先作用于TNFA_HUMAN蛋白靶標(biāo)，但在我們選取的排名前200蛋白中來看，NAG并不集中作用于TNFA_HUMAN蛋白靶標(biāo)，還集中作用于包括KDM6B_MOUSE、OMPA_ECOLI、PAGP_ECOLI、APEA_CLOAB等類別受體，說明NAG對(duì)于TNFA_HUMAN蛋白靶標(biāo)敏感度不高（表7）.同時(shí)，根據(jù)藥物蛋白靶點(diǎn)檢索相似性打分的結(jié)果顯示小分子NAG對(duì)目標(biāo)蛋白TNFA_HUMAN并無具有高度的敏感性，只具有特異結(jié)合性，因此不能將小分子NAG不能作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測(cè)試劑的潛在探針分子.

表7 使用PFSC碼高通量篩選出與3IT8和小分子NAG相似結(jié)合的排名前20的蛋白質(zhì)（10萬數(shù)據(jù)庫）

3 結(jié)論

1）基于靶點(diǎn)診斷可以在RA的早期就具有較高的檢出限，同時(shí)，可以結(jié)合RA的其他征象進(jìn)行綜合評(píng)估，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷、疾病活動(dòng)性和預(yù)后提供了重要的參考，另外，本方法在治療的過程中也可作為觀察療效的一個(gè)重要指征.

2）本研究從蛋白質(zhì)-配體高特異性結(jié)合角度，高通量地虛擬篩選出與TNFA_HUMAN靶點(diǎn)區(qū)結(jié)合敏感度高的小分子307，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測(cè)試劑提供了先導(dǎo)信息.

3）采用PFSC技術(shù)進(jìn)行的高通量篩選整個(gè)PDB數(shù)據(jù)庫（約十萬蛋白質(zhì)）僅需幾個(gè)小時(shí)，大大提高了篩選效率，具有很大的應(yīng)用前景.

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（責(zé)任編輯 胡小洋）

High-throughput screening of biological probe molecules with high specificity to detection of rheumatoid

LI Hongwei1，WU Zhongkui1，YANG Jiaan2，ZHAO Xiaofei2
（1.School of Materials and Engineering Science，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China；2.Micro PharmaTech，Co.Ltd.，Wuhan 430075，China）

From the perspective protein-ligandspecific binding，the protein folding code（PFSC）will be used for high-throughput screening the molecule which is high sensitivity binding to TNFA_HUMAN target area from PDB database as biological probes molecular detection of rheumatoid disease.The results show that 307 small molecules have a relatively high sensitivity and low detection limits，so it can be used as biological probes to detect rheumatoid arthritis，also confirmed protein fingerprint retrieval technology is a rapid，efficient tool for the screening protein structure，also by screening for massive data in the database，providing information for pilot testing reagent development of major diseases.

protein folding shape code；high-throughput screening；rheumatoid arthritis detection；biological probe molecules

O69；Q599

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2015.05.021

1000-2375（2015）05-0506-07

2015-02-03

研究生自主創(chuàng)新基金(2014-zy-014)資助

李洪偉（1988-），女，碩士生；吳仲巋，通信作者，教授，E-mail：zkwu@whut.edu.cn