姜 偉,黃文芳,Claudia Schnabel,Lan Kluwe,Victor-F.Mautner,Reinhard E.Friedrich,Andreas Kurtz
(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川 成都 610072;2.漢堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心 a.神經(jīng)內(nèi)科,b.口腔頜面外科,漢堡 20246;3.柏林夏瑞蒂醫(yī)學(xué)院勃蘭登堡再生醫(yī)學(xué)中心,柏林 10117)
尼羅替尼應(yīng)用于1型神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)腫瘤的體外研究
姜 偉1,黃文芳1,Claudia Schnabel2a,Lan Kluwe2a,Victor-F.Mautner2a,Reinhard E.Friedrich2b,Andreas Kurtz3
(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川 成都 610072;2.漢堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心 a.神經(jīng)內(nèi)科,b.口腔頜面外科,漢堡 20246;3.柏林夏瑞蒂醫(yī)學(xué)院勃蘭登堡再生醫(yī)學(xué)中心,柏林 10117)
目的 通過(guò)體外試驗(yàn)研究尼羅替尼(Nilotinib)對(duì)叢狀神經(jīng)纖維瘤(PNF)培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞和惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤(MPNST)細(xì)胞生長(zhǎng)特性的影響。方法 利用手術(shù)切除的PNF組織培養(yǎng)Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞,然后用不同濃度的尼羅替尼進(jìn)行處理,測(cè)定細(xì)胞增殖、活力、凋亡和胞外膠原酶活性,評(píng)價(jià)藥物的效能。結(jié)果 尼羅替尼處理后,細(xì)胞增殖和活力均下降,下降的程度與藥物濃度成正比,其半數(shù)抑制濃度(IC50)為2.3~10.8 μM。此外,尼羅替尼抑制Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞膠原酶表達(dá)活性,并誘導(dǎo)MPNST細(xì)胞凋亡。結(jié)論 尼羅替尼在體外可有效抑制PNF腫瘤細(xì)胞和MPNST細(xì)胞的增殖和活力,促進(jìn)MPNST細(xì)胞凋亡,值得進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)試驗(yàn)和作用機(jī)制研究。
尼羅替尼;1型神經(jīng)纖維瘤??;叢狀神經(jīng)纖維瘤;惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤;體外研究
叢狀神經(jīng)纖維瘤(plexiform neurofibroma,PNF)是起源于外周神經(jīng)鞘的良性腫瘤,多發(fā)生于1型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1)患者。臨床上,PNF可引起疼痛、容貌損害、壓迫和組織器官功能障礙等,并可進(jìn)行性發(fā)展為惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤(malignant peripheral nerve sheath tumor,MPNST)[1]。MPNST是NF1患者死亡的主要原因之一[2]。目前,臨床上對(duì)PNF和MPNST缺乏有效的藥物治療方案[3]。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)分析尼羅替尼對(duì)Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞增殖、活力、凋亡和膠原酶活性等影響,探討尼羅替尼應(yīng)用于NF1治療的潛力。
1.1 標(biāo)本來(lái)源 病理明確診斷的PNF組織來(lái)自于2014年1~12月在漢堡大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科的10例手術(shù)患者,其中男6例,女4例,年齡12~51歲[(35±10)歲]。研究?jī)?nèi)容經(jīng)學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)審核(批準(zhǔn)號(hào):OB-061/05),患者知悉組織標(biāo)本的使用并簽署知情同意書(shū)。腫瘤組織在手術(shù)切除后置于Hanks平衡鹽溶液(Sigma公司)中,用于Schwann細(xì)胞培養(yǎng)。3株MPNST細(xì)胞(S462、S1507和S1844)由漢堡大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室建立[4]。
1.2 方法
1.2.1 組織消化 手術(shù)切除的PNF組織放入無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液中,切成2~3 mm大小后置于細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液(包括DMEM 500 ml、10%胎牛血清、500 U/ml 的青霉素和鏈霉素、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸鈉;Gibco公司)中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜。然后用含有0.5 mg/ml膠原酶和中性蛋白酶(Roche公司)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)組織進(jìn)行消化,24 h后,利用100 μm不銹鋼網(wǎng)篩分過(guò)濾,1500 rpm離心5 min,棄去上清后的沉淀物為原代細(xì)胞。
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Schwann細(xì)胞的培養(yǎng)表面需預(yù)先使用0.01%多聚賴(lài)氨酸和4 μM層粘連蛋白(Gibco公司)包被,其選擇性培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、0.5 mM 3-異丁基-L-甲基黃嘌呤、2 nM heregulin、2.5 mM胰島素(Sigma公司)。MPNST細(xì)胞的培養(yǎng)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液加0.1 mM 2-巰基乙醇(Gibco公司)。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,每3~5 d換一次培養(yǎng)液。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)對(duì)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化后,1500 rpm離心5 min,收集細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),取3~5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2.3 細(xì)胞鑒定 培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)?;煊谐衫w維細(xì)胞(非腫瘤細(xì)胞)生長(zhǎng)。兩種細(xì)胞通過(guò)特異性免疫熒光抗體染色進(jìn)行鑒定,并計(jì)算Schwann細(xì)胞比例。對(duì)于Schwann細(xì)胞的染色,采用兔抗人S100抗體和FITC結(jié)合的抗兔抗體(綠色);而成纖維細(xì)胞染色采用抗成纖維細(xì)胞抗體(CD90)和FITC結(jié)合的羊抗鼠IgG抗體(紅色)進(jìn)行染色;應(yīng)用碘化丙啶(藍(lán)色)染色細(xì)胞核(DAKO公司)。只有S100陽(yáng)性細(xì)胞≥80%的Schwann細(xì)胞培養(yǎng)物才納入實(shí)驗(yàn)研究。
1.2.4 藥物處理 由于尼羅替尼(Novartis公司)不溶于水,需先配制1 mM的二甲基亞砜(DMSO)-尼羅替尼溶液,然后用培養(yǎng)液稀釋成多個(gè)濃度(0、2、4、6、8、10 μM)。
1.2.5 細(xì)胞增殖和活力檢測(cè) 將Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞培養(yǎng)于96孔平板中,每孔500個(gè)細(xì)胞,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。隨后使用上述不同濃度的尼羅替尼培養(yǎng)液培養(yǎng),每天更換藥物培養(yǎng)液。藥物處理10 d后,分別使用Cell Proliferation-BrdU ELISA和XTT檢測(cè)試劑盒(Roche公司)測(cè)定細(xì)胞增殖和活力。實(shí)驗(yàn)操作遵照試劑盒使用說(shuō)明書(shū),每個(gè)藥物處理濃度重復(fù)6孔,計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。
1.2.6 膠原酶活性測(cè)定 細(xì)胞在不同濃度的尼羅替尼處理24 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,利用膠原酶活性測(cè)定試劑盒(Chondrex公司)進(jìn)行檢測(cè)。利用FLx800熒光分析儀(BioTek公司)檢測(cè)反應(yīng)物熒光強(qiáng)度,激發(fā)光波長(zhǎng)為490 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)520 nm。
1.2.7 MPNST細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 由于Schwann細(xì)胞生長(zhǎng)較慢,數(shù)量較少,而流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡率需要較多細(xì)胞(約2×106cells/ml),因此本研究只檢測(cè)了3株MPNST細(xì)胞在藥物處理后的凋亡率。利用尼羅替尼(0、2、6、10 μM)對(duì)細(xì)胞處理24 h后,采用Annexin-V-binding assay試劑盒和流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)測(cè)定細(xì)胞凋亡率,利用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)(BD公司)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)及其95%可信區(qū)間。
2.1 細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果 Schwann細(xì)胞(圖1a)和成纖維細(xì)胞(圖1b)胞漿分別呈綠色和紅色,細(xì)胞核則呈藍(lán)色。10例PNF樣本培養(yǎng)物的S100陽(yáng)性細(xì)胞比例為(85.9±3.6)%。
圖1 細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果 a:Schwann細(xì)胞;b:成纖維細(xì)胞
2.2 尼羅替尼對(duì)細(xì)胞增殖和活力的影響 尼羅替尼可抑制Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞的增殖和活力,抑制效果與藥物的濃度成正比,IC50為2.3~10.8 μM。見(jiàn)表1。其中,MPNST細(xì)胞株S462對(duì)尼羅替尼最敏感,其增殖和活力的IC50最低,分別為3.1 μM和2.3 μM。
表1 尼羅替尼對(duì)細(xì)胞處理后的半數(shù)抑制濃度(IC50)和95%可信區(qū)間
2.3 尼羅替尼對(duì)膠原酶活性影響 部分PNF組織培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞和2株MPNST細(xì)胞能夠產(chǎn)生膠原酶,其活性高低具有個(gè)體差異性(圖2)。尼羅替尼處理24 h后,膠原酶活性均顯著下降,其中4 μM的尼羅替尼處理后,所有細(xì)胞的膠原酶活性降至1 U/ml以下;而10 μM的尼羅替尼可抑制所有細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶。
圖2 尼羅替尼對(duì)Schwann細(xì)胞和惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤細(xì)胞表達(dá)膠原酶的影響
2.4 MPNST細(xì)胞凋亡率 尼羅替尼處理24 h后,可誘導(dǎo)MPNST細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡率的高低與藥物濃度有關(guān),其中6 μM尼羅替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為最高,而細(xì)胞在10 μM尼羅替尼處理后,凋亡率反而有所下降(圖3)。
圖3 尼羅替尼處理后惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤細(xì)胞的凋亡率 a:尼羅替尼(6 μM)對(duì)S462細(xì)胞處理后的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果散點(diǎn)圖,其中4個(gè)區(qū)域的散點(diǎn)分別表示:活細(xì)胞(左下),早期凋亡細(xì)胞(右下),晚期凋亡細(xì)胞(右上),壞死細(xì)胞(左上);b:3株MPNST細(xì)胞在尼羅替尼處理后的凋亡率
NF1是一種由NF1基因突變引起的常染色體顯性遺傳疾病,臨床主要表現(xiàn)為皮膚咖啡牛奶斑和神經(jīng)纖維瘤。PNF是神經(jīng)纖維瘤的臨床表現(xiàn)之一,NF1患者發(fā)生PNF者占30%~50%[5]。PNF根據(jù)病灶的部位和大小,可累及神經(jīng)、骨骼、血管等多種組織,從而引起疼痛和容貌損害,神經(jīng)、眼、骨骼及內(nèi)臟病變,甚至進(jìn)行性發(fā)展為惡性腫瘤-MPNST。手術(shù)切除是臨床上治療PNF的主要手段,但是由于PNF通常侵入臨近的正常組織,難以徹底切除而極易產(chǎn)生復(fù)發(fā),目前也尚無(wú)有效的藥物可用于臨床PNF的治療[6]。
我們前期的研究發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)和c-KIT在神經(jīng)纖維瘤組織和PNF組織培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞中高表達(dá);而受體酪氨酸激酶抑制劑-伊馬替尼(格列衛(wèi)),在體外能夠有效抑制Schwan細(xì)胞活力和PNF動(dòng)物模型中腫瘤的生長(zhǎng)[7]。但是,近期有2期臨床試驗(yàn)研究表明,伊馬替尼對(duì)PNF患者的有效率只有20%左右[8]。
尼羅替尼是一類(lèi)基于伊馬替尼的新型腫瘤化療藥物,目前臨床上主要用于治療伊馬替尼耐藥或不耐受的費(fèi)城染色體陽(yáng)性的慢性髓性白血病。本研究通過(guò)體外試驗(yàn),探索尼羅替尼對(duì)PNF組織培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞生長(zhǎng)特性的影響,以評(píng)價(jià)尼羅替尼治療PNF的價(jià)值。研究結(jié)果表明,尼羅替尼在體外可有效抑制Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞的增殖和活力,但是具有個(gè)體差異性,其IC50為2.3~10.8 μM。前期有研究檢測(cè)慢性髓性白血病患者口服400 mg/d的尼羅替尼后,血漿藥物峰濃度為(4.27±1.47) μM,與本研究發(fā)現(xiàn)的尼羅替尼抑制細(xì)胞增殖的IC50相近,因此研究結(jié)果具有臨床相關(guān)性。
膠原酶是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一,也是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分,在正常組織中一般表達(dá)較低,而在組織修復(fù)、傷口愈合和腫瘤中高表達(dá)。腫瘤中膠原酶的高表達(dá)主要是由于腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生或者誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶,從而利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。本研究發(fā)現(xiàn)部分Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞可產(chǎn)生膠原酶,其培養(yǎng)液中膠原酶活性表達(dá)增高。尼羅替尼處理后可降低所有細(xì)胞的膠原酶活性,證明了藥物的抗腫瘤作用。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)尼羅替尼可誘導(dǎo)MPNST細(xì)胞的凋亡,而細(xì)胞在10 μM尼羅替尼處理后,凋亡率反而降低,可能是由于高濃度藥物產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用所致。
綜上所述,本研究表明尼羅替尼在體外可有效抑制PNF腫瘤組織培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞和MPNST細(xì)胞增殖、活力和膠原酶的表達(dá),誘導(dǎo)MPNST細(xì)胞的凋亡,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值,值得進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)試驗(yàn)和作用機(jī)制研究。
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Application of nilotinib to neurofibromatosis type 1-associated tumors in vitro
JIANG Wei1,HUANG Wen-fang1,Claudia Schnabel2a,Lan Kluwe2a,Victor-F.Mautner2a,Reinhard E.Friedrich2b,Andreas Kurtz3
(1.Department of Laboratory Medicine,Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital,Chengdu 610072,China;2.a.Department of Neurology;b.Oral and Maxillofacial Surgery,University Medical Center Hamburg-Eppendorf,Hamburg 20246,Germany;3.Brandenburg Center for Regenerative Medicine,Charité-Medical University,Berlin 10117,Germany)
Objective To investigate the effect of nilotinib on plexiform neurofibroma(PNF)-derived Schwann cells and malignant peripheral nerve sheath tumor(MPNST)cells in vitro.Methods The Schwann cells cultured from 10 PNF tissues and 3 established MPNST cell lines were treated by nilotinib with different concentrations.Cell proliferation,viability,apoptosis and collagenase activity were detected to evaluate drug efficacy.Results Nilotinib treatment led to decreased cell proliferation and viability with 50% inhibitory concentration(IC50)varying from 2.3 to 10.8 μM.In addition,nilotinib induced MPNST cell apoptosis and suppressed collagenase activity.Conclusion Nilotinib is able to inhibit proliferation and viability of PNF-derived Schwann cells and MPNST cells in vitro.It is worth performing further in vivo studies and the researches underlying mechanisms of the effects.
Nilotinib;Neurofibromatosis type 1;Plexiform neurofibroma;Malignant peripheral nerve sheath tumor;In vitro study
R739.43
A
1672-6170(2015)05-0065-04
2015-05-27;
2015-07-16)