范迎賽，李 琴，高宗勤，范 開，劉鐘杰

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

制何首烏為蓼科植物何首烏（PolygonummultiflorumThunb.）干燥塊根的炮制加工品，味苦、甘、澀，性微溫，歸肝、心、腎經(jīng)，具有補肝腎、益精血、壯筋骨的功效［1］。制何首烏對骨質(zhì)疏松癥具有一定的防治作用［2］，但其調(diào)節(jié)骨代謝的作用機制尚不清楚。

骨代謝活動包括成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨基質(zhì)沉積與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，骨吸收大于骨沉積即易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松［3］。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志之一［4］，與骨基質(zhì)形成密切相關(guān)［5］；骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）和 核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）是成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞增殖分化的重要因子，與骨吸收活動相聯(lián)系［6］。本試驗通過研究不同濃度制何首烏水提液對體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞 MC3T3-E1增殖、ALP分泌和 OPG／RANKL mRNA 表達(dá)的影響，探索制何首烏調(diào)節(jié)骨代謝可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及主要試劑 制何首烏飲片為北京同仁堂馬連洼藥店產(chǎn)品；α-MEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素溶液為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為Gibico公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；堿性磷酸酶（ALP）活力檢測試劑盒為南京建成公司產(chǎn)品；細(xì)胞RNA提取試劑盒為艾德萊公司產(chǎn)品；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、p-EASY-T3Cloning Kit、質(zhì)粒 DNA 小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、qPCR試劑為全式金公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞株 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 制何首烏水提液的制備 取100g制何首烏飲片常規(guī)煎煮2次，濃縮至1g／mL，置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ们斑^濾除菌，使用含50mL／L FBS的α-MEM培養(yǎng)基配制為不同濃度的制何首烏培養(yǎng)液（0、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8g／mL）。

1.2.2 MC3T3-E1細(xì)胞相對增殖率的檢測 將MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，隨機分組，將細(xì)胞分別作用于100μL不同濃度的制何首烏培養(yǎng)液中。加藥44h或68h后于各孔加入30μL 5g／mL MTT，4h后棄去培養(yǎng)液，于各孔加入150μL DMSO，避光振蕩混勻15min，于酶標(biāo)儀570nm處檢測OD值。細(xì)胞相對增殖率＝試驗組OD值／對照組OD值×100% 。

1.2.3 MC3T3-E1細(xì)胞ALP蛋白表達(dá)的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.2，加藥2d及6d后，收集細(xì)胞上清，按照ALP活力檢測試劑盒（微板法）說明書進(jìn)行操作。其原理為ALP可分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生的游離酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，可于酶標(biāo)儀520nm波長下進(jìn)行檢測。細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP活力＝（試驗組OD值／對照組OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.1mg／mL）×100mL

1.2.4 MC3T3-E1細(xì)胞 OPG、RANKL mRNA 表達(dá)的檢測

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 按照說明書進(jìn)行MC3T3-E1細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄，PCR產(chǎn)物跑膠及切膠回收，載體連接、轉(zhuǎn)化和菌株測序。提取測序陽性菌質(zhì)粒，分別10倍遞增稀釋8組，采用熒光PCR三步法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。普通PCR及熒光PCR退火溫度均為60℃，引物序列見表1。

表1 MC3T3-E1細(xì)胞OPG、RANKL和β-actin引物序列Table 1 Sequence of primers of OPG，RANKL andβ-actin for MC3T3-E1cells

1.2.4.2 OPG、RANKL mRNA 表達(dá)的檢測 將MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，將細(xì)胞分別作用于4mL不同濃度的制何首烏培養(yǎng)液中。1d后，按照說明書提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用實時定量PCR三步法對不同處理組樣本OPG、RANKL和β-actin基因進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 MC3T3-E1細(xì)胞增殖

MC3T3-E1細(xì)胞增殖率檢測結(jié)果見圖1。藥物作用2d及3d后，10-4～10-8g／mL濃度制何首烏水提液均可極顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖（P＜0.01）。

圖1 不同濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細(xì)胞增殖率的影響（n＝5）Fig.1 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on proliferation rate of MC3T3-E1cells（n＝5）

2.2 MC3T3-E1細(xì)胞ALP蛋白的表達(dá)

MC3T3-E1細(xì)胞ALP蛋白表達(dá)檢測結(jié)果見圖2。藥物作用2d后，10-4g／mL濃度制何首烏水提液可顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分泌ALP蛋白（P＜0.05），10-5和10-6g／mL 濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細(xì)胞分泌ALP蛋白無明顯影響（P＞0.05）；作用6d后，10-4、10-5、10-6g／mL濃度制何首烏水提液均可極顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分泌ALP蛋白（P＜0.01）。

圖2 不同濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細(xì)胞分泌ALP的影響（n＝3）Fig.2 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on ALP secretion of MC3T3-E1cells（n＝3）

2.3 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.3.1 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小相符，陽性克隆測序結(jié)果與原始序列100%同源；目的基因熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線主峰單一，無異常增寬，說明引物特異性良好；OPG和RANKL標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.998 0與0.999 0，說明設(shè)計引物擴(kuò)增效率一致。

2.3.2 OPG、RANKL mRNA表達(dá)的檢測 OPG、RANKL mRNA表達(dá)的檢測結(jié)果見圖3。藥物作用1d后，10-4g／mL濃度制何首烏水提液可顯著提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞OPG／RANKL mRNA表達(dá)比（P＜0.05），10-5g／mL 濃度制何首烏水提液可極顯著提高 MC3T3-E1細(xì)胞 OPG／RANKL mRNA表達(dá)比（P＜0.01），10-6、10-7、10-8g／mL濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細(xì)胞OPG／RANKL mRNA表達(dá)比無明顯影響 （P＞0.05）。

圖3 不同濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細(xì)胞OPG／RANKL mRNA 比值的影響（n＝3）Fig.3 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on OPG／RANKL mRNA ratio of MC3T3-E1cells（n＝3）

3 討論

骨基質(zhì)沉積包括成骨細(xì)胞分化增殖、基質(zhì)形成和基質(zhì)鈣化3個時期，ALP活性增高是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志和骨基質(zhì)形成期的特征性表現(xiàn)［4］。MTT檢測結(jié)果顯示，各濃度制何首烏水提液作用MC3T3-E1細(xì)胞2d～3d后均可極顯著上調(diào)細(xì)胞增殖率，說明制何首烏水提液具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。ALP檢測結(jié)果顯示，制何首烏水提液作用細(xì)胞2d后，高濃度可顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALP活力，低濃度無明顯作用，說明高濃度制何首烏水提液具有促MC3T3-E1細(xì)胞分化的作用；作用細(xì)胞6d后，各濃度均可極顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALP活力，說明隨著時間的延長，低濃度的制何首烏水提液也發(fā)揮出促MC3T3-E1細(xì)胞分化的作用。

破骨細(xì)胞是動物機體唯一專職骨吸收的細(xì)胞［7］，成骨細(xì)胞通過分泌OPG和RANKL調(diào)控破骨細(xì)胞活動［8］。RANKL與破骨祖細(xì)胞表面的核因子κB受體活化因子（RANK）結(jié)合后，募集和激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)腫瘤壞死因子相關(guān)因子，促進(jìn)破骨祖細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞［9］，提高破骨細(xì)胞骨吸收活性［6］。OPG屬于腫瘤壞死因子受體超家族，可結(jié)合RANKL并抑制其通過結(jié)合RANK發(fā)揮的促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化的作用，從而抑制骨吸收［10］。熒光定量PCR結(jié)果顯示，高濃度制何首烏水提液能夠提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞OPG／RANKL mRNA表達(dá)比，說明高濃度的制何首烏水提液可能通過上調(diào)成骨細(xì)胞OPG／RANKL表達(dá)比的途徑抑制破骨細(xì)胞增殖分化。有研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的制何首烏醇提物可抑制體外培養(yǎng)大鼠破骨細(xì)胞增殖及分化［11］，推測制何首烏可通過直接作用于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌細(xì)胞因子間接作用于破骨細(xì)胞兩個途徑抑制破骨細(xì)胞增殖分化。

制何首烏的化學(xué)成份主要有蒽醌類化合物（大黃酚、大黃素、大黃酸等）、二苯乙烯苷類化合物、黃酮類化合物、磷脂類化合物和多糖等［12］，有研究發(fā)現(xiàn)何首烏、大黃素和二苯乙烯苷均具有雌激素樣作用［13］。雌激素具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、ALP活性和OPG／RANKL mRNA表達(dá)比［14］。本試驗中，高濃度制何首烏對 MC3T3-E1細(xì)胞的作用是否與其具雌激素樣作用的成份相關(guān)，需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，一定濃度的制何首烏具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化和抑制破骨細(xì)胞增殖分化的作用，產(chǎn)生作用的分子機制與ALP及OPG／RANKL系統(tǒng)相關(guān)。

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