程小娜，張 志，樊雅婷，劉自立，吳發(fā)興，劉 爽，董雅琴，邵衛(wèi)星，楊雨輝，王樹雙，李曉成＊

（1.海南大學(xué)，海南?？?570228；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201）

豬 流 行 性 腹 瀉 （Porcine epidemic diarrhea，PED）是以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病，在我國(guó)豬場(chǎng)大規(guī)模暴發(fā)和流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的損失，其病原主要是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）［1-3］。PEDV 屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒粒子呈多形性，其基因組為單股正鏈RNA，大小約28ku［4］。病毒基因組主要編碼多聚酶蛋白（rab）、纖突蛋白（S）、ORF3蛋白、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核蛋白（N）等，其中，S蛋白由1 383個(gè)氨基酸組成［5］，是病毒的囊膜結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒與受體細(xì)胞結(jié)合吸附、膜融合等方面發(fā)揮重要作用，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的主要免疫蛋白。盡管PEDV的S基因沒有酶裂解位點(diǎn)，但根據(jù)其他冠狀病毒S蛋白序列可以將PEDV S蛋白人為地劃分為S1區(qū)（1-789位氨基酸）和S2區(qū)（790-1 383位氨基酸）；S1可識(shí)別受體，S2負(fù)責(zé)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合［6］。由于受到宿主免疫選擇的壓力和病毒自身進(jìn)化的需要，S蛋白易發(fā)生變異，因此S基因常被用來研究PEDV不同毒株的遺傳演化規(guī)律［7-9］。2014年，本課題組對(duì)山東、河北等地發(fā)生流行性腹瀉的豬場(chǎng)開展了流行病調(diào)查和監(jiān)測(cè)，從中分離和鑒定了數(shù)株P(guān)EDV流行毒株，為進(jìn)一步研究這些毒株流行特點(diǎn)，對(duì)這些毒株的S基因進(jìn)行了克隆測(cè)序和分析，并對(duì)其抗原性和B細(xì)胞線性表位進(jìn)行了深入分析，為更深入了解PEDV流行毒株的分子流行病學(xué)積累了資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 4份PEDV 流行毒株SDZB01、SDZB02、SDZY03和HB04，采集和分離自山東和河北3個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)的小腸及糞便樣品，這3個(gè)豬場(chǎng)的仔豬均發(fā)生嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水和死亡等癥狀，經(jīng)中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心畜病檢測(cè)室鑒定和分離后制備和保存。

1.1.2 材料 Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；RTPCR一步法擴(kuò)增試劑盒、膠回收試劑盒、克隆載體PMD18-T easy Vector、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等為大連Takara公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 取發(fā)病仔豬的糞便樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物，按照Trizol試劑盒說明書提取病毒的RNA，純化后的RNA用20μL DEPC處理水溶解，置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PEDV的S基因擴(kuò)增和測(cè)序 以GenBank中登錄的PEDV毒株CH／GDGZ／2012（KF384500）的S基因序列作為參考序列，將整個(gè)S基因分為S1、S2、S3三段進(jìn)行擴(kuò)增，利用 DNA Star中的Primer Select軟件，分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物S-F1／S-R1、S-F2／S-R2和S-F3／S-F3。引物序列和位置見表1，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 PEDV S基因的擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences for amplification on S gene of PEDV

1.2.3 S1、S2、S3片段的PCR擴(kuò)增與克隆 以提取的樣品 RNA 為模板，以S-F1／S-R1、S-F2／S-R2、S-F3／S-F3為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：S-F1／SR1：42℃1h；94℃5min；94℃40s，50.5℃40s，72℃2min 30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。S-F2／SR2：42℃1h；94℃5min；94℃40s，60.5℃40s，72℃1min 50s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；擴(kuò)增 F3片段的退火溫度為57℃，其他擴(kuò)增條件均與F2片段相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收與PMD18-T Vector載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，重組質(zhì)粒由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列分析 采用 DNA Star軟件對(duì)4株P(guān)EDV野毒株的S基因進(jìn)行拼接接和同源性分析，用CLUSTAL1.83軟件和 MEGA6構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)生樹，用DNA Star中Jameson-Wolf法分析野毒株和疫苗株CV777的抗原性，用BepiPred 1.0Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／BepiPred／）分析B細(xì)胞線性抗原表位，PEDV參考序列為Gen-Bank中所有已發(fā)表S全基因的序列（截止2014年11月20日），分別來自我國(guó)、韓國(guó)、美國(guó)、日本、加拿大等國(guó)2004年-2014年度毒株，共178株，以及CV777、DR13和KPEDV-9等3株疫苗參考序列。

2 結(jié)果

2.1 PEDV流行毒株S基因的擴(kuò)增和測(cè)序

以病料樣品制備的總RNA為模板用一步法擴(kuò)增S1、S2、S3三段S基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析?？梢钥匆姷礁?條分別為1.8、1.6、1.4kb的條帶（圖1），其大小與預(yù)期相符。將4個(gè)PEDV流行毒株分別擴(kuò)增出PEDV S1、S2、S3三段基因的12份陽性克隆菌液送樣進(jìn)行測(cè)序，用Seqman拼接后分別命名這4個(gè)PEDV流行毒株為SDZB01／2014、SDZB02／20l4、SDZY03／2014、HB04／2014。4株P(guān)EDV S基因全長(zhǎng)分別為4 158、4 158、4 161和4 161個(gè)核苷酸，分別編碼1 386、1 385、1 387和1 387個(gè)氨基酸。

圖1 連續(xù)RT-PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)S基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Continuous amplification of spike gene from PEDV field strains by RT-PCR

2.2 S基因進(jìn)化樹分析

MEGA分析顯示，PEDV毒株可以分為G1和G2兩個(gè)大的進(jìn)化分支，在分析的185株P(guān)EDV中，G1分支包括32株P(guān)EDV，占總毒株的17.3%，G2分支含153株P(guān)EDV，占總毒株數(shù)的82.7%，也是近年P(guān)EDV主要的流行優(yōu)勢(shì)分支。G1群可以分為G1.1和 G1.2等2個(gè)次分支，其中，G1.1 含有CV777、DR13、KPEDV等疫苗株、我國(guó)部分毒株及日本分離株（MK），G1.2分支含有8株我國(guó)2011年流行毒株、1株2012年流行毒株、1株2004年毒株（JS-2004）2013年-2014年美國(guó)和加拿大流行毒株。G2群可分為G2.1、G2.2和G2.3等次分支，G2.1為韓國(guó)和日本2011年-2012年流行毒株，G2.1中的G2.1a分支中的毒株為韓國(guó)和日本2011年-2012年流行毒株，而且韓國(guó)和日本流行的毒株均各自成簇，G2.1b中的毒株全部為韓國(guó)2011年流行毒株；G2.2分支由我國(guó)部分2011年-2013年分離毒株組成，分別來自我國(guó)的河北、廣東、廣西、河南等省份，我們此次鑒定的4株毒株中的2株（SDZB01和SDZB02）也位于此進(jìn)化分支內(nèi)；另一個(gè)流行分支是G2.3分支，它包含大多數(shù)PEDV流行毒株，包括中國(guó)2011年-2014年不同省份的毒株，本次的2個(gè)流行毒株（SDZY03和HB04），以及美國(guó)和韓國(guó)近2年的毒株，而且美國(guó)和韓國(guó)毒株的流行毒株均屬于同一個(gè)小分支（圖2）。

圖2 PEDV的同源進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees constructed by spike protein of PEDV field strains

2.3 S基因同源性分析

Megalign軟件分析可知，SDZB01、SDZB02與SDZY03和HB04的同源性為97.5%～97.6%，相互之間的同源性為99.9%。SDZB01、SDZB02與G1群的同源性為92.4%～94.9%，參考病毒株CV777、DR13、KPEDV-9、83P-5（100th）等的同源性為92.4%～93.1%，SDZY03和HB04與與G1群的同源性為92.5%～95.6%，與參考病毒株CV777、DR13、KPEDV-9、83P-5（100th）等的同源性為92.5%～93.3%。SDZB01、SDZB02與 G2分支內(nèi)其他他毒株的同源性分別為96.1%～99.9%，與近兩年出現(xiàn)的美國(guó)毒株Iowa103-2013、Ohio120-2014的同源性分別為97.8%～97.9%。SDZY03和HB04與與G2分支內(nèi)其他他毒株的同源性分別為96.5%～99.9%，與近兩年出現(xiàn)的美國(guó)毒株Iowa103-2013、Ohio120-2014的同源性分別為99.1%～99.2%。

與參考病毒株CV777相比，流行毒株存在2個(gè)插入突變和1個(gè)缺失突變，插入的部位在流行毒株的59-62（GENQ）、140（N），缺失突變位于163-164（NI），除此之外，野毒株的多個(gè)氨基酸位點(diǎn)還存在堿基替換，如27-29位（QST→SAN）、64（S→T）、68-72（GTGIE→AGQHP）、84（Y→H）、86～87（DS→RG）、89（Q→H）、120（I→T）、130-131（DN→SI）、159-164（QDGKNI→SEHS）、178（A→S）、186（I→F）、196（R→K）、200-202（SGG→KRS）、209（E→T）、227-229（SYQ→YYE）、246（EP→DS）、270（V→L）等。

2.4 抗原性分析

用DNA Star中的Protean軟件分析PEDV流行毒株SDZB01和疫苗株CV777，SDZB01等野毒株的抗原區(qū)域明顯增多的區(qū)域?yàn)椋?5-95、250-275、370-380、990-1 030、1 180-1 260等，其他區(qū)域的抗原性與疫苗株類似，詳見圖3。

圖3 CV777和SDZB01毒株S基因的抗原性分析Fig.3 Antigenicity of spike genes of CV777and SDZB01strains

2.5 S基因的B細(xì)胞線性表位分析

使用 BepiPred 1.0Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／BepiPred／）軟件對(duì) PEDV 流行毒株SDZB01和疫苗毒株CV777等毒株進(jìn)行分析，軟件的Threshold取值為0.35，其敏感性為0.49，特異性為0.75。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該毒株SDZB01的線性B細(xì)胞抗原表位有34個(gè)（threshod值＞0.35），分布區(qū)段分別 為 22-27、53-62、66-76、96-104、113-120、133-144、168-171、190-200、219-230、242-253、304-317、350-357、428-436、483-500、521-537、561-572、608-612、627-638、676-680、700-710、724-730、738-745、761-785、866-873、883-891、910-925、1 019-1 028、1 041-1 047、1 123-1 138、1 208-1 217、1 235-1 246、1 259-1 266、1 283-1 298、1 370-1 374位氨基酸，其中S1片段有23個(gè)，S2片段有11個(gè)，這個(gè)結(jié)果與S的功能相一致，也進(jìn)一步證實(shí)了S1片段是S基因的主要抗原區(qū)域，35個(gè)線性表位中，Threshold最大值超過1.0的線性表位有15個(gè)。與參考毒株CV777相比，4個(gè)野毒株有6個(gè)區(qū)域的Threshold值有明顯差異，其中148-156和346-353兩個(gè)區(qū)域的Threshold值比CV777毒株小，而其余區(qū)域的Threshold值都大于CV777毒株，詳見表2和表3。

3 討論

S基因是PEDV主要的抗原決定基因，其基因結(jié)構(gòu)和功能與病毒的感染性、致病性、抗體的產(chǎn)生和細(xì)胞結(jié)合能力密切相關(guān)。本文研究發(fā)現(xiàn)，PEDV流行毒株的S基因在進(jìn)化樹上與CV777、DR13等疫苗株存在明顯區(qū)別，二者之間的同源性也只有92.4%～93.3%，從進(jìn)化樹上可以看出疫苗株與流行毒株分別位于不同的進(jìn)化分支，表明PEDV流行毒株已經(jīng)與疫苗株存在較大的變異。

Li Z L等［10］分析了我國(guó)南部部分 PEDV 流行株S基因的同源進(jìn)化樹，他將PEDV分為3個(gè)進(jìn)化分支，G1-G3型，其中G1和G2型實(shí)際上與本文的G1群一致，G3型與本文的G2群一致，其研究結(jié)果顯示PEDV的流行毒株均屬于G3群，與本文PEDV流行毒株主要屬于G2型的研究結(jié)果一致。這說明G2群是全球目前PEDV主要的優(yōu)勢(shì)流行毒株，該分支既有美國(guó)、加拿大、墨西哥等美洲毒株，也有中國(guó)、韓國(guó)和日本等國(guó)的毒株。

從地域上看，PEDV流行毒株具有一定的地區(qū)分布性特點(diǎn)：①除了中國(guó)以外的其他國(guó)家的流行毒株分布相對(duì)集中。不同國(guó)家的分離株基本屬于同一個(gè)分支，如G1.2、G2.1a、G2.1b和G2.3各分支中韓國(guó)和日本等國(guó)家的流行毒株都形成一個(gè)單獨(dú)的進(jìn)化分支；②中國(guó)PEDV流行毒株缺乏地區(qū)性。很多進(jìn)化分支中既有河北省，也有廣東省，甚至一個(gè)省內(nèi)部的分離株也難以形成單獨(dú)的進(jìn)化分支，如本文山東省的3株毒株分布于2個(gè)不同的進(jìn)化分支，其中1株與河北省的1株高度同源。這一結(jié)果提示我國(guó)豬群PEDV的發(fā)病和流行可能與我國(guó)生豬無序調(diào)運(yùn)密切相關(guān)，生豬的頻繁調(diào)運(yùn)增加了生豬之間相互流通的可能性，導(dǎo)致不同的PEDV流行毒株之間相互交叉感染。從時(shí)間上看，PEDV毒株沒有見到明顯的時(shí)空聚集性，同一個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)可以含有不同年代的流行毒株。

表2 CV777的S基因氨基酸位置及相應(yīng)位置的SDZB01毒株的Threshold值Table 2 Different threshold values of S genes from CV777strain and corresponding SDZB01strain at some certain regions

表3 SDZB01與CV777毒株Threshold明顯差異的氨基酸位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)值Table 3 Significant difference of Threshold values and amino acid sites for S gene from SDZB01and CV777strain

從同源性上看，近年來PEDV的流行毒株與疫苗株的同源性不斷加大，2012年，GDGZ／12毒株與CV777、DR13的氨基酸同源性分別為97.7%和98.0%［11］，而本文的同源性只有92.3%和92.4%，這說明流行毒株不斷和持續(xù)受到疫苗的免疫壓的影響。

從B細(xì)胞線性表位上看，與CV777毒株比較，發(fā)現(xiàn)SDZB01有4段B細(xì)胞線性表位的Threshold值大于CV777毒株，分別位于52-62、360-365、375-378和752-781等處。特別是52-62位，流行毒株相比CV777插入了4個(gè)額外的氨基酸（GENQ），從而增加了一個(gè)超強(qiáng)的抗原表位（出現(xiàn)一個(gè)7個(gè)連續(xù)的Threshold值超過1的氨基酸PTGENQG），這樣一個(gè)超強(qiáng)抗原表位的出現(xiàn)必然影響PEDV毒株的許多生物學(xué)特性。長(zhǎng)期以來，人們一直想弄清楚PEDV野毒難以培養(yǎng)的機(jī)制，現(xiàn)在普遍認(rèn)為，PEDV受體結(jié)合域是PEDV與感染細(xì)胞結(jié)合的部位，其結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)決定了病毒的侵染性高低，孫東波等［12］研究認(rèn)為PEDV毒株CV777的S基因的249-529位氨基酸區(qū)域是PEDV的受體結(jié)合域，本文發(fā)現(xiàn)的另外2個(gè)存在差異的抗原表位，即346-353aa和360-365aa，也恰好位于此區(qū)間。對(duì)于表位346-365aa來說，SDZB01和SDZB02流行毒株的Threshold值約是疫苗株的2倍，SDZY03和HB04流行毒株甚至是疫苗株的3.5倍；對(duì)于表位375-378aa，盡管SDZY03和HB04流行毒株的Threshold值略高于疫苗株，但SDZB01和SDZB02流行毒株的Threshold值仍是疫苗株的2.5倍。這種抗原表位的差異也可能影響PEDV流行毒株與細(xì)胞受體的結(jié)合，從而影響其感染性。另外，在對(duì)S基因抗原表位的研究中，Sun D B等認(rèn)為［13-14］，S基因636-789位氨基酸特別是其中的748-755aa和764-771aa還是S基因的2個(gè)引起PEDV中和抗體的線性表位，這一結(jié)果與752-781段抗原表位基本一致，在此區(qū)域，盡管野毒株和疫苗株之間只有3個(gè)堿基發(fā)生了變異（S→L、S→D、T→M），但其 Threshold值卻由0.655迅速上升到1.235。這種變異是否影響了野毒株的抗原性還有待進(jìn)一步研究。

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