樊曉盼等

摘 要：利用發(fā)酵菠菜替代亞硝酸鹽的作用，開發(fā)新型綠色肉制品。將菠菜打漿后進行自然發(fā)酵和接菌（薩科WBL-45復合菌株）發(fā)酵，發(fā)酵過程中分別為不調節(jié)pH值和每0.5 h調節(jié)pH值至中性，測定發(fā)酵過程中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的變化。然后將加工豬肉灌腸分3組，CK組（不添加亞硝酸鈉）、SN組（添加0.15 g/kg亞硝酸鈉）、FS組（添加136 g/kg發(fā)酵菠菜液），測定豬肉灌腸在冷藏過程中的抗氧化性（TBARs）、色差和亞硝酸鹽殘留量。結果表明：菠菜打漿后添加10 g/100 g葡萄糖、接種量4.25×106 CFU/mL、發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵12 h時，菠菜中的硝酸鹽可以最大程度地轉化為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽含量達到1 100 mg/kg。添加了發(fā)酵菠菜液的豬肉灌腸在冷藏過程中TBARs值明顯比CK組低，且與SN組（亞硝酸鈉組）差異不顯著，亞硝酸鹽殘留量小于30 mg/kg，符合國標要求，由于菠菜中含有天然葉綠素、葉黃素等，使產品呈現(xiàn)誘人的鮮亮綠色。

關鍵詞：發(fā)酵菠菜液；豬肉灌腸；硝酸鹽；亞硝酸鹽；品質

Abstract： Nitrite plays a very important role in processing meat products. However， at the same time， it may cause the potential hazard to forme N-nitrosamine. This experiment focuses on finding a new alternative to nitrite for the development of green meat products. Spinach leaves were mashed into a paste and split into two aliquots that were either naturally fermented or inoculated with a composite starter culture （WBL-45） and fermented. During the fermentation process， each aliquot was either adjusted to neutral pH after every half an hour or without pH adjustment， and the changes in nitrate and nitrite contents were monitored. Three groups of pork sausages were set up： CK （without sodium nitrite）， SN （with

0.15 g/kg sodium nitrite） and FS （with 136 g/kg fermented spinach） and the antioxidant activity （thiobarbituric acid reactive substances， TBARs， which are formed as a byproduct of lipid peroxidation）， colgor difference and nitrite residue were measured during the fermentation process. The results showed addition of 10 g/100 g glucose （by mass） to mashed spinach followed by fermentation at 38 ℃ for 12 h with the starter culture inoculated at a level of 4.25 × 106 CFU/mL maximized the conversion of nitrate to nitrite， reaching 1 100 mg/kg. The value of TBARs in pork sausage with fermented spinach was apparently lower than that in CK group and showed no significant difference from that in SN group. Furthermore， the amount of nitrite residue in SN group was smaller than 30 mg/kg， measuring up to the requirement of the Chinese national standard. The bright green color of the sausages was attractive due to the presence of chlorophyll and lutein naturally occurring in spinach.

Key words： fermented spinach； pork sausages； nitrate； nitrite； quality

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）03-0015-05

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201503004

亞硝酸鹽能使腌肉制品呈現(xiàn)穩(wěn)定的紅色，并具有獨特的風味和抗氧化作用[1]，亞硝酸鹽還具有抑制肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botulinum）生長繁殖的作用，從而防止肉毒毒素產生，降低安全風險[2]。另有研究證實硝酸鹽在微生物的作用下轉化為亞硝酸鹽也可產生上述同樣作用[3]。因此，亞硝酸鹽被作為不可替代的添加劑應用在腌肉制品領域[4]。然而亞硝酸鹽亦可與肉制品中的次級胺，如仲胺、叔胺、氨基酸等發(fā)生反應，形成致癌物質N-亞硝胺化合物，誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變，目前已成為食品安全關注的焦點之一[5-7]。為了達到產品既具有腌肉的品質和特點，也能不直接添加人工合成的亞硝酸鈉，“天然腌制”被學者提出，其原理是利用特定微生物將天然來源的硝酸鹽轉化為天然型的亞硝酸鹽，從而替代傳統(tǒng)的合成型亞硝酸鹽[9-10]。蔬菜作為一種天然物質，富含硝酸鹽，所以被作為硝酸鹽來源廣泛應用到了天然有機腌肉制品中，其中芹菜是應用最多的，其天然硝酸鹽含量達到2 100 mg/kg[11-12]。微生物主要利用的是具有硝酸鹽還原性的菌，如肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）等。菠菜中富含維生素、礦物質、蛋白質、纖維素等，目前對葉菜類蔬菜產品安全性評價指標主要集中在農藥殘留和硝酸鹽、亞硝酸鹽含量上。研究結果顯示，人體積累的硝酸鹽大約有80%～92%來自于蔬菜，我國菠菜中硝酸鹽的含量為239～4 044 mg/kg，屬中等偏高水平[13]。本研究利用菠菜中天然含有的硝酸鹽，依靠薩科WBL-45復合菌株（肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌）將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，添加到豬肉灌腸的加工中，以期提高灌腸的品質，開發(fā)一種新型的綠色肉制品。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

薩科WBL-45菌株由意大利Sacco公司提供，薩科WBL-45

菌株由肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）組成，總菌數(shù)4.25×1010 CFU/g。

新鮮豬通脊肉、豬背膘肉、新鮮菠菜、豬腸衣、香辛料、淀粉等，均購于天津市西青區(qū)紅旗農貿市場。

亞鐵氰化鉀、對氨基苯磺酸、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、飽和硼砂、7.5%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，其中含有0.1%丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）和0.1%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液，0.02mol/L β-硫代巴比妥酸、氯仿、亞硝酸鈉標準溶液（0.2 mg/mL）等均為化學純。

1.2 儀器與設備

CM-14斬拌機 西班牙美卡公司；CM-5色差儀 日本Konica Minolta公司；SX-300滅菌鍋 日本Tomy公司；FA2004精密電子天平 上海精科儀器公司；

TU-1800分光光度儀 日本Hmadzu公司；IMS-50制冰機 河南兄弟儀器設備有限公司； WH2漩渦混合機 上海滬西分析儀器廠有限公司；PB-10酸度計 德國賽多利斯科學儀器有限公司；KDF-2513組織搗碎機 天津市達康電器有限公司；ZXL（B）-250半自動蒸熏爐 沈陽市東方食品機械制造廠；TV-5L不銹鋼灌腸機 廣東樂王實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菠菜液的實驗方案設計

將新鮮菠菜去根、清洗、瀝水、切碎后，用組織搗碎機打成漿，得到菠菜液進行發(fā)酵實驗。菠菜液的發(fā)酵實驗分4 組，每組均取50 g菠菜液放入250 mL錐形瓶中，加入事先已滅過菌的20 g/100 g葡萄糖濃溶液50 mL，使菠菜液中的葡萄糖質量濃度為10 g/100 g，然后按照實驗設計方案（接菌或不接種；發(fā)酵過程調節(jié)pH值或不調節(jié)）在恒溫搖床中進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度38 ℃，發(fā)酵時間24 h，期間每隔3 h，測定其硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量變化。具體分組情況如下：1組為不接種，完全依靠蔬菜液中自身含有的微生物進行發(fā)酵，發(fā)酵過程也不調節(jié)pH值；2組為不接種，自然發(fā)酵過程中每隔0.5 h對發(fā)酵液調節(jié)一次pH值，使其穩(wěn)定在7.0～7.1之間；3組為接種薩科WBL-45菌株，接種量為4.25×106 CFU/mL（稱取0.1 g薩科WBL-45溶于10mL無菌水中，取1 mL加入實驗3組的錐形瓶中搖勻），38 ℃發(fā)酵12 h，期間不調節(jié)pH值；4組為接菌量同第3組，但發(fā)酵過程中每0.5 h將pH值調節(jié)至7.0～7.1。所有實驗重復2 次。

1.3.2 發(fā)酵菠菜豬肉灌腸實驗方案設計

1.3.2.1 豬肉灌腸的加工工藝

配方：豬通脊肉800 g、豬背膘肉200 g、食鹽25 g、復合磷酸鹽3 g、抗壞血酸鈉2 g、白糖4 g、葡萄糖4 g、白胡椒粉2.5 g、豆蔻粉1 g、雞蛋70 g、淀粉80 g、冰水160 mL。

工藝流程：原料肉選擇和修整→低溫腌制→加入輔料斬拌→灌腸→烘烤→蒸煮→烤制→包裝→冷藏

工藝操作要點：1）原料肉整理：瘦肉修去筋膜，用絞肉機絞碎（3 mm篩板孔徑），背膘切塊。2）斬拌：按照配方稱取各輔料后，依次在斬拌機中加入絞碎瘦肉，開動斬拌機低速轉1 min，加入輔料、背膘和冰水，高速斬拌5 min，使肉餡斬拌成肉糜狀態(tài)。3）灌腸：用灌腸機將肉餡灌入豬腸衣中，注意松緊度，每隔14 cm用線繩結扎，灌好后針刺排氣，溫水漂洗。4）烘烤：在多功能煙熏爐里烤制，烘烤溫度65～80 ℃，時間2～3 h，使腸的中心溫度達55～65 ℃。5）蒸煮：保持水溫80～85 ℃。當肉餡中心溫度達到70～72 ℃時為止。6）烤制：蒸煮好后再一次放入烤爐里進行烤制，溫度50 ℃，時間2 h，表面干燥即可。

1.3.2.2 豬肉灌腸的分組

CK組：按照以上配方添加，即不添加亞硝酸鈉，也不添加發(fā)酵菠菜液；SN組（sodium nitrite，SN）：添加0.15 g/kg亞硝酸鹽鈉；FS組（fermented spinach，F(xiàn)S）：按照菠菜發(fā)酵實驗條件的第4組（即接種4.25×106 CFU/mL

薩科WBL-45菌株，發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵時間12 h，期間0.5 h調節(jié)pH值至中性）進行批量發(fā)酵得到發(fā)酵菠菜液，經測定發(fā)酵菠菜液中亞硝酸鹽含量為1 100 mg/kg，按照國標中規(guī)定的亞硝酸鈉最大添加量為0.15 g/kg計算，在豬肉灌腸加工中發(fā)酵菠菜液的添加量為136 g/kg。

按照以上設計方案加工出3組豬肉灌腸，真空包裝后4 ℃冷藏4周，每周測定產品中硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量、脂質過氧化（thiobarbituric acid reactive substances assay，TBARs）值和色差。實驗重復2 次。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 硝酸鹽含量的測定

按照NYT 1279—2007《蔬菜、水果中硝酸鹽的方法測定 紫外分光光度法》[14]測定。

1.3.3.2 亞硝酸鹽含量的測定

按照GB 500933—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》分光光度法測定[15]。

1.3.3.3 pH值的測定

稱取5 g樣品，加入15 mL蒸餾水，勻漿30 s后，將pH計探頭插入其中，讀取示數(shù)。

1.3.3.4 TBARs值的測定

采用Liza 等[16]的方法。取5.0 g切碎的樣品，加15 mL

1.3.3.5 色度的測定

制備均勻樣品，平鋪在色差平皿底部，將色差儀進行白板校正后檢測其紅度（a*）值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0進行分析。

2 結果與分析

由圖1可知，在發(fā)酵過程中，4組菠菜液中的硝酸鹽含量變化趨勢一致，均呈先下降，大約發(fā)酵到12～15 h，又開始出現(xiàn)回升現(xiàn)象。但這種變化的速率不同，第4組（即接菌并調節(jié)pH值）硝酸鹽下降速度最快，其次是第3組，第1組和第2組硝酸鹽下降速率稍慢。硝酸鹽在發(fā)酵過程中含量的變化是消耗與生成的一個動態(tài)平衡過程。發(fā)酵初期由于菠菜本身攜帶的乳酸菌活動微弱，形成抑菌的物質（乳酸、過氧化氫、乳酸菌肽等）含量低，因此發(fā)酵菌株快速繁殖[17]，硝酸鹽含量在發(fā)酵初期迅速降低。隨著抑菌物質的積累和發(fā)酵體系中碳源等營養(yǎng)物質的消耗，發(fā)酵菌株的生長代謝受到抑制，硝酸鹽還原作用減弱，當還原作用小于生成作用，硝酸鹽含量就會回升[18-19]。

2.2 菠菜液發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化

由圖2可知，4組亞硝酸鹽含量變化出現(xiàn)一個峰值，但峰值的高低和峰值出現(xiàn)的時間點不同。1組和2組盡管無人為接種WBL-45復合菌株，但菠菜自身攜帶的硝酸還原菌會將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽。經過統(tǒng)計軟件顯著性分析可得，1組（不調節(jié)pH值）的亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)在發(fā)酵第15 h，且含量為310 mg/kg，而2組（調節(jié)pH值）的亞硝酸鹽峰值較1組提前3h出現(xiàn)，且含量明顯提高（P<0.05），達到556 mg/kg。3組和4組均接種4.25×106 CFU/mL WBL-45復合菌株，由于4組在發(fā)酵過程中不斷調節(jié)pH值，其亞硝酸鹽的生成量顯著高于3組

（P<0.05），且峰值（1 100 mg/kg）較3組的峰值（567 mg/kg）提前3 h出現(xiàn)。實驗說明新鮮菠菜中本身含有硝酸鹽還原作用的微生物，且在低pH值條件下依然能將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，在發(fā)酵過程中接種

WBL-45復合菌株并不斷調節(jié)pH值，可顯著提高亞硝酸鹽的生成量。實驗過程中產生“亞硝酸鹽峰值”，可能是因為亞硝酸鹽生成的同時也伴隨著大量亞硝酸鹽降解，這種亞硝酸鹽降解主要是由于亞硝酸還原酶的微生物作用結果[20]

和乳酸菌發(fā)酵引起的酸降解[21]，即當發(fā)酵液pH值降到4.0～4.5時，亞硝酸鹽迅速分解，并且這種降解作用隨著pH值的降低而增強。所以，由于發(fā)酵前期發(fā)酵菌種生長代謝活躍，亞硝酸鹽大量生成，且作用效果大于其他微生物對于亞硝酸鹽的分解作用，所以亞硝酸鹽含量在前期出現(xiàn)上升，進入到發(fā)酵后期時，亞硝酸鹽的酸降解作用要大于其生成作用，亞硝酸鹽含量就會下降，從而出現(xiàn)了“亞硝酸鹽峰值”。

2.3 3組豬肉灌腸制品在冷藏過程中TBARs值變化

由圖3可知，3 組豬肉灌腸在冷藏過程中，隨貯藏時間的延長TBARs值呈現(xiàn)上升趨勢。但CK組在冷藏各時間點的TBARs值均高于SN組和FS組（P<0.05），而FS組的TBARs值在冷藏過程中又高于SN組。3組豬肉灌腸的配方和工藝是一樣的，差別就在于SN組添加了亞硝酸鹽，F(xiàn)S組添加了含有亞硝酸鹽的發(fā)酵菠菜液，實驗說明發(fā)酵菠菜液中含有的亞硝酸鹽也起到了良好的抗氧化作用，可以替代化學合成型亞硝酸鹽的作用。

2.4 3組豬肉灌腸制品在冷藏過程中亞硝酸鹽含量的變化

由圖4可知，3 組豬肉灌腸中的亞硝酸鹽含量符合國標要求（≤30mg/kg），在冷藏過程中，亞硝酸鹽含量有降低的趨勢，因為CK組的配料中沒有添加亞硝酸鹽或發(fā)酵菠菜液，所以CK組的亞硝酸鹽含量一直小于5 mg/kg，SN組和FS組的亞硝酸鹽含量在冷藏過程中均低于

30 mg/kg，兩組之間差異不顯著（P>0.05）。

由圖5可知，因為SN組添加了亞硝酸鹽，所以其a*值一直明顯高于CK組和FS組，灌腸呈現(xiàn)腌肉制品特有的鮮紅色；CK組沒有添加亞硝酸鹽或發(fā)酵菠菜液，所以灌腸呈現(xiàn)暗紅色；FS組的a*值呈現(xiàn)負值是因為盡管含有亞硝酸鹽的發(fā)色作用，但菠菜的葉片中含有葉綠素（包括葉綠素a和葉綠素b）、葉黃素及胡蘿卜素等天然色素，色素含量較高，呈現(xiàn)藍綠、黃綠、橙黃和黃色，正是由于這些色素的掩蓋作用，導致豬肉灌腸呈現(xiàn)綠色，為開發(fā)新的綠色肉制品開辟新的思路。

3 結 論

本實驗將菠菜打漿，利用薩科WBL-45復合菌株發(fā)酵菠菜液，發(fā)酵溫度38 ℃，發(fā)酵過程中每0.5 h調節(jié)pH值至中性，當發(fā)酵到12 h，菠菜中的硝酸鹽可以最大程度轉化為亞硝酸鹽，含量達到1 100 mg/kg。將這種發(fā)酵菠菜液按照0.15 g/kg的亞硝酸鹽折算后添加到豬肉灌腸中，實驗結果發(fā)現(xiàn)，產品在冷藏過程中TBARs值明顯比CK組低，亞硝酸鹽含量符合國標要求，產品呈現(xiàn)鮮亮的綠色，可為市場開發(fā)一種新式綠色肉制品。

參考文獻：

[1] VASAVADA M N， CORNFORTH D P. Evaluation of milk mineral antioxidant activity in beef meatballs and nitrite-cured sausage[J]. Journal of Food Science， 2005， 70（4）： C250-C253.

[2] PEGG R B， SHAHIDI F. Processing of nitrite-free cured meats[M]// NOLLET L M L， TOLDRA F. Advanced technologies for meat processing. London： Taylor & Francis Ltd， 2006： 309.

[3] JOSEPH G S， JAMES N B. Cured meat products without direct addition of nitrate or nitrite： what are the issues？[J]. Meat Science， 2007， 77： 136-147.

[4] ?ZTEKIN N， NUTKU M S， ERIM F B. Simultaneous determination of nitrite and nitrate in meat products and vegetables by capillary electrophoresis[J]. Food Chemistry， 2002， 76（1）： 103-106.

[5] MIRVISH S S， REIMERS K J， KUTLER B， et al. Nitrate and nitrite concentrations in human saliva for men and women at different ages and times of the day and their consistency over time[J]. European Journal of Cancer Prevention， 2000， 9（5）： 335-342.

[6] 方長發(fā)， 馬儷珍， 劉會平， 等. 固相微萃取技術及其在N-亞硝胺分析中的應用[J]. 肉類研究， 2009， 23（4）： 49-50.

[7] 馬儷珍， 南慶賢， 方長法. N-亞硝胺類化合物與食品安全性[J]. 農產品加工： 學刊， 2006（12）： 8-11.

[8] BACUS J. Natural ingredients for cured and smoked meats[C]//Proceedings of the 59th Reciprocal Meat Conference， 2006： 77-78.

[9] JOSEPH S， SEBRANEK J， BACUS J. Natural and organic cured meat products： regulatory， manufacturing， marketing， quality and safety issues[J]. American Meat Science Association White Paper Series， 2007， 1： 1-15.

[10] 王海燕， 張春江， 羅欣. 發(fā)酵香腸中微生物產生的酶及其作用[J]. 肉類研究， 2001， 15（1）： 15-17.

[11] JAMES H S， ARCOT J H. Nitrate and nitrite quantification from cured meat and vegetables and their estimated dietary intake in Australians[J]. Food Chemistry， 2009， 115： 334-339.

[12] 李殿波， 鄭喬， 李海東， 等. 不同施肥處理對菠菜硝酸 鹽及亞硝酸鹽含量的影響[J]. 北方園藝， 2014（3）： 166-168.

[13] 郭曉紅， 楊潔彬， 張建軍. 甘藍乳酸發(fā)酵過程中亞硝酸鹽峰消長機制及抑制途徑的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 1989（4）： 26-34.

[14] 中華人民共和國農業(yè)部. NY/T 1279—2007 蔬菜、水果中硝酸鹽的測定[S]. 北京： 中國標準出版社， 2007.

[15] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 5009.33—2010 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定[S]. 北京： 中國標準出版社， 2010.

[16] LIZA J， DAREN C F， CHARLES E C， et al. Color and thiobarbituric acid values of cooked topsirloin steaks packaged in modified atmospheres of 80% oxygen， or 0.4% carbonmonoxide， or vacuum[J]. Meat Science， 2005， 69： 441-449.

[17] 張慶芳. 蔬菜腌漬發(fā)酵亞硝酸鹽降解機理和提高白菜品質方法的研究[D]. 沈陽： 沈陽農業(yè)大學， 2001.

[18] 董競， 馮美琴， 周超， 等. 侗族酸肉中硝酸鹽還原菌的分離篩選及其特性究[J]. 食品科學， 2009， 30（13）： 241-244.

[19] 何淑玲， 李博， 藉保平， 等. 泡菜發(fā)酵過程中硝酸鹽還原酶活性的研究[J]. 食品科技， 2005（1）： 94-97.

[20] 潘鶴楓， 劉秀珠. 北方酸菜中亞硝酸鹽生成規(guī)律的研究[J]. 中國釀造， 1988（6）： 28-31.

[21] 劉玉龍. 大白菜腌制過程中亞硝酸鹽形成規(guī)律的研究[D]. 沈陽： 沈陽農業(yè)大學， 1985.