林海青，楊金龍，姚曉東，李 曉

糖尿病心臟自主神經(jīng)病變（diabete cardiac neuropathy，DCAN）在糖尿病患者中發(fā)生率可達(dá)60%以上［1，2］。在自主神經(jīng)損傷過(guò)程中，可出現(xiàn)迷走神經(jīng)功能下降而交感神經(jīng)功能相對(duì)增強(qiáng)［3－5］，造成自主神經(jīng)功能異常，使房顫、室性心律失常和無(wú)痛性心肌梗死的發(fā)生率增加，加重糖尿病病情。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)的生長(zhǎng)發(fā)育、分化、營(yíng)養(yǎng)、再生中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)觀察有關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在糖尿病心臟中的變化及桂枝湯對(duì)炎癥反應(yīng)的影響，探索桂枝湯是否對(duì)其有調(diào)節(jié)作用，為運(yùn)用中醫(yī)藥治療DCAN提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠55只，雄性，8周齡，體重280 g～300 g，由濟(jì)寧魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK魯20080002）。

1.2 試劑與材料 鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma－Aldrich公司產(chǎn)品，批號(hào)：329A039）；甲鈷胺片［彌可保，衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120307A］；酪氨酸羥化酶（TH）、乙酰膽堿酶轉(zhuǎn)移酶（CHAT）Elisa檢測(cè)試劑盒（R＆D公司分裝產(chǎn)品，批號(hào)：20121117）；神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）Elisa檢測(cè)試劑盒（Abcam公司分裝產(chǎn)品，批號(hào)：ab100757）；神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白（GAP－43）Elisa檢測(cè)試劑盒（R＆D公司分裝產(chǎn)品，批號(hào)：20121117）；睫狀生長(zhǎng)因子（CNTF）Elisa檢測(cè)試劑盒（PeproTech，批號(hào)：0711065）；白介素1β（IL－1β）Elisa檢測(cè)試劑盒（Abcam公司，批號(hào)：GR127340－1）；白介素6（IL－6）Elisa檢測(cè)試劑盒（Abcam公司，批號(hào)：GR112814－1）；腫瘤壞死因子（TNF－α）Elisa 檢 測(cè) 試 劑 盒 （Abcam 公 司，批 號(hào)：GR126667－2）。桂枝湯：按照桂枝湯原方比例煎煮濃縮，加入輔料（輔料選用赤鮮糖醇和甜菊素比例99∶1）制成桂枝湯顆粒，1 g顆粒劑相當(dāng)于2 g生藥。使用時(shí)候配制水溶液，濃度為每毫升1 g生藥。彌可保配制成濃度為0.03 mg／mL的懸濁液。

1.3 方法

1.3.1 制作糖尿病模型 大鼠55只，隨機(jī)取10只作為空白對(duì)照組，其余大鼠給予鏈脲佐菌素腹腔注射（60 mg／kg），空白對(duì)照組大鼠給予等量枸櫞酸鈉緩沖液。每日測(cè)定空腹血糖，以胰島素皮下注射或者補(bǔ)充STZ方法，使血糖穩(wěn)定（＞16.7 mmol／L）。4周后，取成模大鼠39只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、彌可保組、桂枝湯組。各組持續(xù)灌胃4周，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組分別給予生理鹽水2 mL／d；彌可保組予彌可保0.15 mg／（kg·d）；桂枝湯組予桂枝湯水煎劑4.0g生藥／（kg·d）。各組給予充足水和普通飼料飼養(yǎng)。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 灌胃4周后，大鼠隔夜禁食，4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。開(kāi)胸取心臟，剪取左心室組織，加入生理鹽水制備20%心肌組織混懸液，取上清液，采用Elisa法，檢測(cè)心肌中TH、CHAT、GAP－43、NGF、CNTF及 炎 癥 因 子IL－1β、IL－6、TNF－α的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組血糖及體重比較 大鼠腹腔注射STZ后，出現(xiàn)多飲、多食、體重下降、精神狀態(tài)差。除去死亡大鼠，最終剩余39只。STZ大鼠血糖升高，體重下降。藥物干預(yù)后，桂枝湯組血糖仍較高，體重升高。詳見(jiàn)表1、表2。

表1 各組大鼠血糖變化（x±s） mmol／L

表2 各組大鼠體重變化（x±s） g

2.2 各組心肌中TH、CHAT及TH／CHAT比較CHAT催化膽堿和乙酰輔酶A合成乙酰膽堿（ACh），CHAT被吸收進(jìn)入突觸小泡可作為膽堿能神經(jīng)元的可靠標(biāo)記物［6］。TH可作為交感神經(jīng)活動(dòng)的標(biāo)記物［7］。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組左心室TH明顯升高（P＜0.01），CHAT明顯下降（P＜0.01），TH／CHAT升高（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，彌可保組TH升高（P＜0.05），桂枝湯TH降低（P＜0.05），CHAT升高（P＜0.01），TH／CHAT降低（P＜0.01）。與彌可保組比較，桂枝湯組在降低TH（P＜0.0 1），升高CHAT（P＜0.05），降低TH／CHAT（P＜0.01）方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表3。

表3 各組心肌中TH、CHAT及TH／CHAT比較（x±s） ng／mL

2.3 各組心肌中各神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組左心室GAP－43和NGF明顯升高（P＜0.01），CNTF明顯降低（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，彌可保組可升高CNTF（P＜0.05），桂枝湯組可明顯升高 GAP－43、CNTF（P＜0.01），降低NGF（P＜0.05）。桂枝湯組與彌可保組比較，CNTF和GAP－43升高，NGF降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表4。

表4 各組左心室中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量比較（x±s） ng／mL

2.4 各組炎癥因子IL－1β、IL－6及 TNF－α的含量比較與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組左心室中IL－1β、IL－6及TNF－α明顯升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，桂枝湯組、彌可保組炎癥因子下降（P＜0.05或P＜0.01）；桂枝湯組與彌可保組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)表5。

表5 各組左心室中炎癥因子的濃度比較（x±s） pg／mL

3 討 論

神經(jīng)的生長(zhǎng)及損傷后的修復(fù)、再生需多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子共同參與。GAP－43存在于交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)［8］，具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、發(fā)育及再生的作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)在STZ大鼠心肌中GAP－43蛋白含量增高，而且一直持續(xù)6周［10］。CNTF因其能促進(jìn)體外培養(yǎng)的雞胚副交感睫狀節(jié)神經(jīng)元存活而被命名［11］，CNTF對(duì)迷走神經(jīng)有較強(qiáng)促進(jìn)作用［12，13］，在迷走神經(jīng)與心肌的突觸形成及功能形成方面起著極為重要的作用［14］。

NGF在交感神經(jīng)重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，NGF表達(dá)增加能夠提高心臟交感神經(jīng)的活性，增強(qiáng)交感神經(jīng)對(duì)心臟的支配［15］。研究表明，NGF過(guò)度表達(dá)能增加心臟交感神經(jīng)的密度［16］，而敲除NGF基因可使交感神經(jīng)密度下降［17］。Hellweg等［18］研究顯示STZ大鼠的心室中，NGF含量在糖尿病造模成功后第3周上升至最高，而到第12周時(shí)出現(xiàn)明顯下降，在第6個(gè)月時(shí)，心室中的NGF降至（50.9±7.0）%。Kim 等［19］認(rèn)為 NGF升高不是糖尿病神經(jīng)病變的促使因素，而是神經(jīng)受損的結(jié)果。因此，認(rèn)為NGF的過(guò)度表達(dá)預(yù)示交感神經(jīng)受損并出現(xiàn)過(guò)度增生。

TH和CHAT可分別反映交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)活性。TH／CHAT可表示交感與迷走神經(jīng)平衡狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌中NGF、GAP－43含量明顯增加，說(shuō)明在糖尿病導(dǎo)致的損傷中，交感神經(jīng)得到修復(fù)增生，CNTF含量下降，說(shuō)明迷走神經(jīng)損傷后恢復(fù)較弱，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的變化導(dǎo)致迷走神經(jīng)損傷而交感神經(jīng)亢進(jìn)，由交感－迷走平衡轉(zhuǎn)為交感神經(jīng)占優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)為T(mén)H和TH／CHAT升高，CHAT下降。

糖尿病心臟神經(jīng)病變屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病、心病”范疇，其病機(jī)為熱毒傷絡(luò)，營(yíng)衛(wèi)不調(diào)，耗傷心神?！靶闹魃裰尽?，神志損傷與自主神經(jīng)損傷有較強(qiáng)的相關(guān)性?！峨y經(jīng)》云：“損其心者，調(diào)其營(yíng)衛(wèi)”，桂枝湯是調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的基礎(chǔ)方。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，彌可?？缮逤NTF，但對(duì)NGF和GAP－43作用較弱，而桂枝湯可以抑制NGF升高，促進(jìn)CNTF和GAP－43升高，說(shuō)明桂枝湯可抑制交感神經(jīng)亢進(jìn)，促進(jìn)迷走神經(jīng)的恢復(fù)，增加迷走神經(jīng)的活性，調(diào)節(jié)和維持自主神經(jīng)平衡，表現(xiàn)為T(mén)H較模型對(duì)照組下降，CHAT升高，TH／CHAT下降。

炎癥反應(yīng)在糖尿病心臟自主神經(jīng)病變進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。炎癥因子不僅影響糖尿病病情，亦參與神經(jīng)損傷。糖尿病大鼠血清中炎癥因子 TNF－α、IL－1β、IL－6水平升高［20］。神經(jīng)損傷后，TNF－α首先升高，IL－1β相繼升高，兩者參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，促進(jìn)吞噬髓鞘磷脂，從而造成神經(jīng)損傷［21］。孫玉清等［22］研究顯示，IL－6與糖尿病心臟自主神經(jīng)病變程度密切相關(guān)，心臟自主神經(jīng)病變程度越重，IL－6越高。炎癥因子亦參與胰島素抵抗及血管內(nèi)皮損傷機(jī)制，加重微血管損傷，從而造成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性損傷。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠左心室勻漿中炎癥因子TNF－α、IL－1β、IL－6表達(dá)增加，桂枝湯能抑制炎癥因子的表達(dá)，表明桂枝湯能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的炎癥反應(yīng)，抑制TNF－α、IL－1β、IL－6的表達(dá)，從而抑制高血糖對(duì)心臟自主神經(jīng)的炎癥損傷。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桂枝湯干預(yù)后，對(duì)血糖沒(méi)有明顯影響，說(shuō)明桂枝湯在持續(xù)高血糖狀態(tài)下，仍然具有調(diào)整自主神經(jīng)的作用，并且可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。另外，桂枝湯可增加動(dòng)物體重，說(shuō)明桂枝湯對(duì)動(dòng)物的整體狀態(tài)也有較好的調(diào)節(jié)作用。

既往研究證明桂枝湯可降低自發(fā)性糖尿病大鼠心肌炎癥因子和對(duì)心肌損傷有保護(hù)作用［23］，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了桂枝湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及抑制炎癥反應(yīng)，治療糖尿病造成的心臟自主神經(jīng)損傷，維持交感－迷走平衡，為臨床治療DCAN提供線索和依據(jù)。

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