孫 雨，馬世春，董 浩，王曉英

（中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102600）

牛副結(jié)核?。˙ovine paratuberculosis）是由副結(jié)核分支桿菌引起的以牛慢性增生性、頑固性腸炎和進(jìn)行性消瘦為特征的人畜共患傳染病［1］。牛副結(jié)核病的主要臨床癥狀與病理變化是頑固性腹瀉、漸進(jìn)性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺褶、慢性肉芽腫性回腸炎。本病給養(yǎng)牛業(yè)造成很大的損失［2］。由于本病潛伏期長，傳播快，加之人工培養(yǎng)副結(jié)核分支桿菌難度又高，因此加強(qiáng)對(duì)該病的流行病學(xué)調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室診斷研究對(duì)其綜合防控具有十分重要的意義［3］。除常規(guī)的臨床診斷外，牛副結(jié)核病的確診依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷方法，主要是血清學(xué)診斷和病原學(xué)診斷方法［4］。由于我國大部分省市的牛均未進(jìn)行副結(jié)核疫苗免疫，因此血清抗體陽性則表明其已經(jīng)感染［5－8］。為了更全面、準(zhǔn)確掌握我國部分省市牛副結(jié)核病的流行和分布情況，并進(jìn)行相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)分析和科學(xué)防控，本研究使用法國ID－VET 公司生產(chǎn)的牛副結(jié)核病抗體ELISA 試劑盒對(duì)我國河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重慶6個(gè)省市2014年－2015年收集的3 600頭牛血清樣品進(jìn)行了牛副結(jié)核病感染調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 牛副結(jié)核病抗體ELISA 檢測試劑盒，購自法國ID－VET 公司。

1.1.2 血清樣品 2014年－2015年采自河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重慶6 個(gè)省市的規(guī)?；B(yǎng)殖場、種畜場、散養(yǎng)戶牛血清樣品共3 600份。按照樣品來源省份分，其中河北800份、山西800份、青海200份、新疆1 000 份、西藏200 份、湖北200份、重慶400份。按照樣品來源分，規(guī)?；B(yǎng)殖場牛血清1 000份，種畜場牛血清600份，集貿(mào)市場400份，散養(yǎng)戶牛血清1 600份。按照動(dòng)物品種分，奶牛血清2 400份，肉牛血清600份，牦牛血清400份。

1.2 方法

1.2.1 牛副結(jié)核病抗體檢測 在ELISA 抗原包被反應(yīng)孔中加入稀釋好的血清樣本110μL，振蕩10s，充分混勻，置21℃溫育45 min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次后拍干，加入酶標(biāo)記物100μL，置21℃溫育30min后，棄去液體，洗滌3次后拍干，加入底物100μL，振蕩混勻，21℃避光反應(yīng)15min后，加入終止液100μL，振蕩10s，5min～30min 內(nèi)用酶標(biāo)儀測定其光密度值，檢測每批血樣均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性和空白對(duì)照。具體操作見牛副結(jié)核病抗體（Ig G）檢測試劑盒（ELISA 方法）。

1.2.2 結(jié) 果 判 定 陽 性 樣 本OD 值（OD 陽 性）＞0.35；陽性樣本OD 值（OD 陽性）與陰性樣本OD值（OD 陰性）的比值＞3 的條件下檢測的結(jié)果有效，否則試驗(yàn)不成立，需重新做。

按照以下S／P 百分值計(jì)算判定每個(gè)樣品的結(jié)果：S／P＝（OD 樣本－OD 陰性）／（OD 陽性－OD陰性）×100%；當(dāng)S／P≤60%時(shí)結(jié)果判為陰性；S／P≥70%時(shí)結(jié)果判為陽性；60%＜S／P＜70%時(shí)結(jié)果判為可疑。

2 結(jié)果

2.1 2014－2015年我國部分省市牛副結(jié)核病抗體檢測結(jié)果

本次共調(diào)查牛血清樣品3 600份，檢出牛副結(jié)核病抗體陽性樣品共82份，平均陽性率為2.29%。各省市的牛血清均有陽性樣品，陽性率從0.5%～3.75%不等。按照省份區(qū)分，重慶的陽性率最低為0.5%，山西的陽性率最高為3.75%，新疆陽性率為2.2%、河北陽性率為2%、青海陽性率為1.5%、重慶陽性率為0.75%、湖北陽性率為0.5%（圖1）。

圖1 2014－2015年我國部分省市牛副結(jié)核病抗體檢測結(jié)果Fig.1 The test results of bovine paratuberculosis antibodies in some provinces of China from 2014to 2015

2.2 不同來源的牛血清中副結(jié)核病抗體檢測結(jié)果

對(duì)2014－2015年不同來源的3600份牛血清通過ELISA 方法檢測發(fā)現(xiàn)，采集于各省市散養(yǎng)戶、種畜場、規(guī)模場和集貿(mào)市場的牛血清均能檢測出副結(jié)核抗體陽性，陽性率從0.17%～3.06%不等。按照樣品來源分，散養(yǎng)戶的牛陽性率最高為3.06%，其次是集貿(mào)市場的牛陽性率為2.75%，規(guī)?；B(yǎng)殖場的牛陽性率為2.1%，最后是種牛場的牛陽性率為0.17%（圖2）。

2.3 不同品種來源牛血清中副結(jié)核抗體檢測結(jié)果

各省市的奶牛、牦牛和肉牛的血清中均能檢測出副結(jié)核抗體，陽性率從0.83%～2.79%不等。按照動(dòng)物品種來源分，牦牛血清的陽性率最高為2.79%，其次是奶牛血清的陽性率為2.5%，最后是肉牛血清的陽性率為0.83%（圖3）。

圖2 不同來源的牛血清中副結(jié)核抗體檢測結(jié)果Fig.2 The detection results of paratuberculosis antibodies in bovine sera from different sources

圖3 不同品種的牛血清中副結(jié)核抗體檢測結(jié)果Fig.3 The detection results of paratuberculosis antibodies in bovine sera from different varieties

3 討論

采用法國ID－VET 公司生產(chǎn)的牛副結(jié)核病抗體ELISA 檢測試劑盒對(duì)我國河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重慶6個(gè)省市采集的3 600份牛血清樣品進(jìn)行了牛副結(jié)核病抗體檢測，從樣品來源地、養(yǎng)殖方式與采樣動(dòng)物品種上進(jìn)行了一次初步的調(diào)查，樣品來源覆蓋面較大，涉及到全國6個(gè)省市的規(guī)模化養(yǎng)殖場、種畜場、散養(yǎng)戶的奶牛、肉牛和與牦牛。各省市 的牛血 清 均 有 陽 性，陽 性 率 從0.5%～3.75%不等，但是山西、河北、新疆等北方地區(qū)牛副結(jié)核病的陽性率一定程度上高于湖北與重慶等南方地區(qū)，說明牛副結(jié)核病在北方地區(qū)的流行情況要高于南方地區(qū)。按照樣品來源分，散養(yǎng)戶的牛陽性率最高為3.06%，其次是集貿(mào)市場為2.75%，規(guī)?；B(yǎng)殖場為2.1%，最后是種牛場為0.17%。說明養(yǎng)殖方式對(duì)該病的流行也有一定的影響。被副結(jié)核分支桿菌污染的周圍環(huán)境、水源、糞便等是副結(jié)核病的主要傳染來源。大型的規(guī)模化養(yǎng)殖場與管理嚴(yán)格的種牛場消毒衛(wèi)生條件較好，人員、動(dòng)物出入管理嚴(yán)格，飼養(yǎng)方式相對(duì)科學(xué)，感染率要小于養(yǎng)殖方式較為落后的農(nóng)村散養(yǎng)戶。按照動(dòng)物品種來源分，奶牛血清的陽性率最高為2.79%，其次是牦牛血清的陽性率為2.5%，最后是肉牛血清的陽性率為0.83%。從結(jié)果上可以分析出奶牛對(duì)副結(jié)核分支桿菌最為易感，副結(jié)核病給奶牛業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失也最大，其中牛奶是副結(jié)核病的主要感染源，被副結(jié)核分支桿菌污染的牛奶極易將病原傳染給犢牛與人類造成公共衛(wèi)生安全隱患。牦牛的血清陽性率明顯高于肉牛，可能原因是大部分高原牦牛采取散養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，衛(wèi)生條件較差，管理較為混亂，被副結(jié)核分支桿菌污染的糞便隨意排放到草原上嚴(yán)重污染了飼養(yǎng)環(huán)境。牦牛在放養(yǎng)食草過程中很容易采食到被病原菌污染的牧草，從而造成腸道感染，而肉牛養(yǎng)殖大多采取規(guī)范化的規(guī)模養(yǎng)殖場或養(yǎng)殖小區(qū)進(jìn)行飼養(yǎng)，飼喂方式與衛(wèi)生環(huán)境明顯好于在高山草原放養(yǎng)的牦牛。牛副結(jié)核病對(duì)肉牛與牦牛的生產(chǎn)性能危害也較大，該病容易引起牛慢性增生性、頑固性腸炎和進(jìn)行性消瘦，嚴(yán)重影響肉牛的產(chǎn)肉性能，所以牦牛與肉牛的副結(jié)核病同樣需要引起獸醫(yī)公共衛(wèi)生方面的高度重視。

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