張丹俊，戴 銀，沈?qū)W懷，趙瑞宏，胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥230031）

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovius，MDPV）引起的急性傳染病，主要侵害1周齡～3周齡的雛番鴨［1－2］。該病具有高度的傳染性，其發(fā)病率較高，病死率可達(dá)50%～80%；病雛番鴨常表現(xiàn)為喘氣、消瘦、拒食、軟腳和腹瀉等主要臨床癥狀，剖檢可見消化道（尤其是小腸）病變［3－6］。MDPV 屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬成員，核酸為單鏈、線性DNA，大小約為5kb。基因組有2個(gè)主要開放閱讀框架，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）和結(jié)構(gòu)蛋 白（VPl、VP2、VP3），其 中 VP3 基 因 全 長1 605nt，編碼534個(gè)氨基酸，是病毒的重要保護(hù)性抗原蛋白［7］。

目前，我國多地雛番鴨因番鴨細(xì)小病毒病大量死亡，該病已是嚴(yán)重危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［8－11］。近期安徽省部分番鴨群也發(fā)現(xiàn)了類似病癥，且呈現(xiàn)暴發(fā)的趨勢，前期課題組對病毒進(jìn)行了分離鑒定，確定為番鴨細(xì)小病毒病。本研究進(jìn)一步克隆了番鴨細(xì)小病毒的VP3基因，并進(jìn)行了序列分析，為研究該病的流行發(fā)病趨勢和基因遺傳進(jìn)化特征，以及制備更有效的細(xì)小病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 番鴨細(xì)小病毒毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸埃希菌BL21 和載體pMDl8－T 為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 工 具 酶 和 試 劑 DNA 提 取 試 劑、DNA Marker DL 2 000、T4連接酶等購自寶生物工程（大連）有限公司；dNTP、Taq 酶、瓊脂糖（電泳純）為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；DNA 清潔／PCR 產(chǎn)物清潔試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒為杭州維特潔生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 經(jīng)Oligo 6.0 軟件分析，參照GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的番鴨細(xì)小病毒基因序列（登錄號(hào)：KC171936），設(shè)計(jì)一對特異性擴(kuò)增引物。P－1：5′－CCGAACCTGTGGCAGCATCTAAAATGGCAGAG－3′，P－2：5′－TGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAA－3′。預(yù)期目的擴(kuò)增片段大小為1 733bp，命名為AH－MDPV－VP3。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 基因組DNA 的提取 將MDPV 分離株接種13日齡番鴨胚，收集72h后死亡胚胎的尿囊液，將尿囊液經(jīng)5 000r／min離心10min，取上清，分別加入100g／L的SDS至終濃度為20g／L，再加蛋白酶K 至50μg／mL，充分混勻，37℃水浴2h后，用等量飽和酚抽提1 次，再用等量飽和酚－氯仿抽提2次，用等體積氯仿抽提1次，加入1／10體積3mol／L NaAc（pH 5.2）和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，16 000 r／min離心10 min，沉淀病毒核酸，TE（pH 8.0）溶解，置－20℃保存?zhèn)溆茫?2］。

1.2.3 基因的擴(kuò)增 以提取的基因組DNA 為模板，采用P1 和P2 為上、下游引物，擴(kuò)增基因AHMDPV－VP3。PCR 反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA 2.5μL，Taq DNA 聚合酶0.5μL，加雙蒸水補(bǔ)足60μL。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5 min；94℃30s，56℃30s，72℃3min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8g／L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 基因序列分析 測序后的基因序列在NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／blast.cgi）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對搜索，選擇番鴨、鴨和鵝細(xì)小病毒株共9條參比序列作為分析樣本，登錄號(hào)分別為番 鴨 KC171936 和 KM093740，鵝 KC478066、KC996730、KC184133、FJ240170 和KP053633，鴨AY382891和AY382892。使用Clustal X 1.83 軟件比對序列，采用DNAStar、MegAlign等軟件分析各序列特征。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA 的提取

所提取的兩個(gè)樣品基因組DNA 在2 000bp上方均有明顯的DNA 條帶（圖1），雖然部分條帶有輕微降解拖尾現(xiàn)象，但由于PCR 的高敏感性，該模板能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 番鴨AH－MDPV－VP3基因的擴(kuò)增

以提取的基因組DNA 為模板，P1和P2為引物PCR 擴(kuò)增獲得了一條約1 700bp 大小的特異性DNA 片段（圖2），將擴(kuò)增的基因產(chǎn)物純化、測序。結(jié)果與GenBank中登錄的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對。

2.3 同源性分析

測 序 結(jié) 果 表 明，AH－MDPV－VP3 基 因 全 長1 733bp，包含完整MDPV VP3蛋白閱讀框，1 605 bp編碼534個(gè)氨基酸。將AH－MDPV－VP3與其他在GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的番鴨、鵝和鴨的相應(yīng)VP3基因氨基酸序列進(jìn)行同源性比較（圖3）。結(jié)果表明，10條基因序列的同源性介于89.3%～100%之間；AH－MDPV－VP3與兩個(gè)番鴨基因KC171936和KM093740序列同源性分別為100%和98.3%；與鵝細(xì)小病毒同源性均相對較低，介于96.1%～96.4%之間；而與臺(tái)灣分離的鴨細(xì)小病毒基因AY382891和AY382892 同源性分別為91.6%和90.8%。同時(shí)可見，鵝細(xì)小病毒毒株間同源性均大于98.9%，兩個(gè)鴨細(xì)小病毒毒株同源性為99.1%，說明各物種VP3基因較為保守。

圖1 基因組DNA 電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genome DNA

圖2 AH－MDPV－VP3基因的PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of AH－MDPV－VP3gene

2.4 序列進(jìn)化分析

采用MEGA 分析軟件，將獲得的10條番鴨、鵝和鴨的細(xì)小病毒VP3氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果可見，所比對序列分為番鴨、鵝和鴨細(xì)小病毒3 個(gè)類群。AH－MDPV－VP3與國內(nèi)兩個(gè)番鴨細(xì)小病毒基因KC171936和KM093740聚集為一組，進(jìn)一步證實(shí)三者親緣關(guān)系較近，來源于共同祖先；而與5個(gè)鵝細(xì)小病毒和2個(gè)臺(tái)灣分離的鴨細(xì)小病毒分離株VP3基因遺傳距離則相對較遠(yuǎn)。

圖3 VP3氨基酸序列同源性比對（%）Fig.3 The homology alignment of VP3amino acid sequences（%）

圖4 VP3氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of VP3amino acid sequences

3 討論

近年來，隨著番鴨養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，出現(xiàn)了許多新的疫病和重新流行的疫病，番鴨細(xì)小病毒已經(jīng)成為危害世界番鴨養(yǎng)殖業(yè)較為嚴(yán)重的病毒之一［13］。本研究克隆了番鴨細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白的VP3基因，該基因包含全長1 605bp的完整蛋白閱讀框，編碼534個(gè)氨基酸。氨基酸序列同源性和進(jìn)化分析表明，AH－MDPV－VP3與國內(nèi)兩個(gè)番鴨細(xì)小病毒基因同源性較高，來源于共同祖先；而與鵝細(xì)小病毒，尤其與臺(tái)灣分離的鴨細(xì)小病毒同源性相對較低，遺傳距離也相對較遠(yuǎn)；同時(shí)可見番鴨、鵝和鴨細(xì)小病毒的VP3基因各自均較為保守，僅有少數(shù)氨基酸發(fā)生變異。此外，多個(gè)研究也表明不同來源的鵝細(xì)小病毒株VP3基因核苷酸和氨基酸序列的同源性均較高，顯示鵝VP3基因較為保守［14－16］。

鵝細(xì)小病毒是小鵝瘟這一烈性傳染病的病原，鵝細(xì)小病毒既能感染鵝又可以感染番鴨，同樣是危害極為嚴(yán)重的疫病之一。鵝細(xì)小病毒與番鴨細(xì)小病毒的病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組、病理變化和臨床癥狀等方面較為相似，在實(shí)際生產(chǎn)中小鵝瘟雛鵝活疫苗和抗血清也能夠提高雛番鴨對番鴨細(xì)小病毒的抵抗能力［12，17－19］。本研究也發(fā)現(xiàn)番鴨細(xì)小病毒與鵝細(xì)小病毒VP3基因同源性相對較低，但也均大于94.9%，說明兩者的相似性較高。盡管鵝細(xì)小病毒與番鴨細(xì)小病毒有很多相似的特點(diǎn)，但感染的寄主卻有不同，兩者在抗原特征上存在較大差異，且不同分離株致病性也存在差異，因此研究其相關(guān)抗原基因的變異對于疫苗株的篩選有著極其重要意義。研究表明利用鵝細(xì)小病毒VP3基因制備的亞單位疫苗能夠誘導(dǎo)鵝產(chǎn)生鵝細(xì)小病毒抗體，使新生雛鵝獲得良好的免疫保護(hù)［20］。VP3是病毒的主要衣殼蛋白，約占總蛋白含量的80%，內(nèi)含有主要抗原決定簇成分，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白［17，21］。所以該基因在細(xì)小病毒的免疫診斷及免疫防控中無疑具有不可替代的作用［21］。本研究克隆了番鴨細(xì)小病毒的VP3 基因，并分析其分子結(jié)構(gòu)特征，可為深入研究番鴨細(xì)小病毒遺傳學(xué)特點(diǎn)，以及獲得更有效的預(yù)防控制方法奠定了基礎(chǔ)。

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