王 洋，胡 博，張海玲，魯榮光，呂 爽，劉 昊，孫彥剛，馬凡舒，趙建軍，張 蕾，薛向紅，史 寧，白 雪，徐淑娟，范思寧，凌明玉，李欣彤，閆喜軍＊

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所經濟動物疫病研究室，吉林長春130112；2.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118）

干擾素（interferon，IFN）是機體抗病毒感染的主要細胞因子，具有調節(jié)機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分［1］。根據(jù)基因序列、染色體定位和受體特異性可以將IFN 分為3種類型，IFN－α和IFN－β屬于Ⅰ型干擾素，是機體抗病毒感染的主要細胞因子，具有抑制病毒復制和間接的防護病毒感染的作用［2－3］。IFN－γ屬于Ⅱ型干擾素，又稱免疫干擾素，主要由活化的T 細胞和NK 細胞分泌，在病毒感染過程中具有活化免疫細胞的功能，即在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用［4－5］。Ⅲ型干擾素是2003年發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞因子，稱為IFN－λ，其抗病毒機制與Ⅰ型IFN 相類似［6］。IFN 是機體內各種抗病毒因子的潛在活化劑，可在較短時間內使機體處于抗病毒狀態(tài)，使機體對病毒的感染作出快速抵抗［7］。因此，對機體內IFN 進行定量分析，不僅對免疫機制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果評估、器官移植、過敏反應，而且對多種胞內病原感染的診斷等方面都具有極其重要的理論價值和應用價值。實時熒光定量PCR（realtime PCR）具有靈敏度高、特異性好和操作簡便等特點，已成為核酸定量檢測的常用手段，該技術在犬細胞因子的檢測中也有應用［8］。本研究擬建立一種用于檢測水貂IFN－α、IFN－β和IFN－γ mRNA 的熒光定量RT－PCR 方法，對水貂IFN－α、IFN－β和IFN－γ等細胞因子的表達水平作出評價，為水貂細胞因子的定量檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和毒種 水貂由中國農業(yè)科學院特產研究所實驗動物基地提供；水貂腸炎病毒強毒株（SMVP－11）由本課題組分離和保存，病毒效價為5×106TCID50／mL。

1.1.2 主要試劑和儀器 淋巴細胞分離液，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；Axy Prep Multisource Tota RNA Miniprep Kit、Axy Prep DNA Gel Extraction Kit和Axy Prep Plasmid Miniprep Kit，杭州AXYGEN 公司；一步法反轉錄試劑盒，北京全式金生物技術有限公司；SYBR Premix?Ex TaqTMⅡ和pMD18－T，大 連TaKaRa 公 司；Light Cycler?96熒光定量PCR 儀，羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ基因的核苷酸序列（登錄號分別為：EF392835.1、EU863613.1、EF581890.1和KJ888148.1）［9］，用Primer 5.0軟件設計熒光定量PCR特異性引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 淋巴細胞總RNA 提取與cDNA 制備 采集水貂新鮮血液2.5mL置于肝素抗凝管，加入等體積生理鹽水。取5mL淋巴細胞分離液加入無菌離心管中，將5mL稀釋后的血液緩慢加入分離液的液面上，低速冷凍水平離心機400r／min離心20min。用吸管小心吸取中間層淋巴細胞，加入5mL生理鹽水中，充分混勻，400r／min離心20min。棄去上清液，沉淀用5mL生理鹽水洗2次，獲得淋巴細胞。按RNA 提取試劑盒和一步法反轉錄試劑盒操作說明獲得cDNA，置－20℃保存。

表1 MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ引物Table 1 The primers of MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γ

1.2.3 質粒標準品的制備 以獲得的cDNA 為模板，常規(guī)PCR 擴增MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ基因。反應體系為10×ExTaq buffer 3 μL，dNTP Mixture 1.2 μL，TaKaRa ExTaq 0.6μL，上、下 游 引 物 各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 補足30μL。PCR 擴增程序為：95℃4min；95℃25s，55℃30s，72℃1min，33個循環(huán)；72℃延伸7min。15g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，凝膠回收產物連接于pMD18－T 載體，連接產物轉化到Trans 5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)并挑取單克隆菌落于液體LB 培養(yǎng)基37℃搖振培養(yǎng)12h，提取質粒經鑒定正確后，紫外線分光光度計測定OD 值，換算成拷貝數(shù)并進行倍比稀釋。

1.2.4 反應條件的優(yōu)化 在其他條件不變的情況下，通過比較Ct值、熒光強度及熔解曲線是否有引物二聚體峰來確定最佳退火溫度。在優(yōu)化的退火溫度條件下，對引物濃度（5mmol／L～20mmol／L）進行優(yōu)化。

1.2.5 熒光定量PCR 標準曲線的建立 以10倍梯度稀釋已知拷貝數(shù)的重組質粒，熒光定量PCR 檢測，反應完成后，應用Light Cycler 96 熒光定量PCR 儀自帶分析軟件自動生成標準曲線。

1.2.6 熒光定量PCR 敏感性、重復性和特異性試驗 將101拷貝／μL～107拷貝／μL 的質粒標準品作為模板進行熒光定量PCR 檢測，確定反應的靈敏性。將4種質粒標準品稀釋成3個濃度梯度，進行組內、組間重復檢測，每個稀釋度3 個重復。按1.2.2的方法進行總RNA 的提取和cDNA 的合成，用MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β 和MiIFN－γ 的各自引物進行熒光定量RT－PCR 檢測，并對熒光定量PCR 產物進行熔解曲線分析。

1.2.7 臨床樣品檢測 選取細小病毒抗體陰性水貂18只，隨機選取15只水貂，口服接種水貂腸炎病毒（濃度5×106TCID50／mL），10 mL／只。其余3只水貂作為正常對照，口服正常細胞培養(yǎng)液。在不同的攻毒時間采集水貂血液，按照1.2.2進行RNA提取及cDNA 合成。采用建立的檢測方法，對Mi－IFN－α、MiIFN－β及MiIFN－γmRNA 相對表達量進行檢測，并對結果進行分析。

2 結果

2.1 質粒標準品的制備

由水貂外周血淋巴細胞提取的總RNA 經反轉錄成cDNA 后，經PCR 擴增，獲得MiGAPDH（254 bp）、MiIFN－α（150bp）、MiIFN－β（170bp）和MiIFN－γ（104bp）基因的目的片段（圖1），經膠回收、連接、轉化、搖菌、提取質粒、酶切及測序鑒定，證實成功構建出帶有目標片段的重組質粒，濃度依次為11μg／mL、3.5μg／mL、15.7μg／mL和20μg／mL，換算成拷貝數(shù)分別為3.4×1010拷貝／μL、1.12×1010拷貝／μL、5.0×1010拷貝／μL和6.54×1010拷貝／μL。用無菌水進行梯度稀釋，制備成101拷貝／μL～107拷貝／μL的標準質粒，OD260nm／OD280nm 介于1.80～1.90 之間。

圖1 目的片段PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of target fragments

2.2 反應條件的優(yōu)化

根據(jù)預試驗對反應條件進行優(yōu)化。退火溫度55℃，引物濃度10pmol／μL，有最低的Ct值和最高的熒光強度，并且無二聚體?？傮w系20μL：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ10 μL，上、下 游 引 物 各0.5μL，ddH2O 7μL，模板2μL。反應在Light Cycler 96熒光定量PCR 儀中進行，反應程序為：95℃30s；95℃6s，55℃30s，72℃30s，40個循環(huán)，每一次循環(huán)結束后收集熒光。

2.3 標準曲線的制作

以優(yōu)化好的條件和程序對質粒標準品進行熒光定量PCR 擴增，經Light Cycler 96 熒光定量PCR軟件分析得到MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β 和MiIFN－γ的動力學擴增曲線（圖2）和標準曲線（圖3）。標準曲線的相關系數(shù)R2均為1.00，各點間的線性關系良好，擴增效率高，標準曲線符合試驗標準。

2.4 敏感性、特異性和重復性試驗

圖2 細胞因子檢測基因動力學擴增曲線Fig.2 Dynamics curve of MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γmRNA detection

2.4.1 敏感性試驗 結果表明，MiGAPDH、Mi IFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ 的重組質粒拷貝數(shù)濃度在101～107拷貝／μL范圍內擴增效果良好，最小檢出下限為10 拷貝重組質粒／μL，陰性對照組（NTC）無信號。

2.4.2 特異性試驗 熔解曲線分析表明（圖4），MiGAPDH、MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γ的質粒標準品只出現(xiàn)特異性單峰，無非特異性產物和引物二聚體的峰值出現(xiàn)，陰性對照組（NTC）沒有雜峰，表明所建立的方法具有較好的特異性。

2.4.3 重復性試驗 從MiGAPDH、MiIFN－α、Mi－IFN－β和MiIFN－γ質粒標準品中分別選取3個濃度梯度進行組內和組間重復性試驗，結果顯示，變異系數(shù)（CV）均小于4.5%，表明該方法具有較好的重復性（表2）。

圖3 MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－β和MiIFN－γ實時熒光定量PCR 標準曲線Fig.3 Real－time PCR standard curves of MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γ

圖4 MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－β和MiIFN－γ實時熒光定量PCR 熔解曲線Fig.4 Real－time PCR melting curves of MiGAPDH，MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γ

2.5 臨床樣品檢測

采集水貂感染腸炎病毒后不同時間點的血液樣品，檢測水貂感染腸炎病毒后不同時間外周血淋巴細胞 中MiIFN－α、MiIFN－β 及MiIFN－γ 的mRNA水平（圖5）。結果表明，MiIFN－α、MiIFN－β和Mi－IFN－γmRNA 水平均在感染6d 達到最高峰值，MiIFN－α的量要比MiIFN－β和MiIFN－γ高兩個數(shù)量級，并且在感染期（4d～6d）MiIFN－αmRNA 水平明顯提高，MiIFN－α mRNA 量在2d 為1.73×102拷貝／μL，在6d 時MiIFN－α 相對表達量高達2.38×103拷貝／μL。

3 討論

干擾素（IFN）是由受到病毒或其他干擾素誘生劑刺激巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞等而產生的一種具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調節(jié)活性等多方面的生物學功能的糖蛋白［10－11］。科研人員從作用機理、功能結構和醫(yī)療作用等方面對干擾素展開了長期深入的研究［12］。隨著人用干擾素制劑的廣泛使用，獸用干擾素的相關研究也逐漸開展。謝麗君等［13］研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）體外感染豬肺泡巨噬細胞（PAMs）對其產生Ⅰ型干擾素mRNA 轉錄水平的影響，結果PRRSV 可導致PAMs產生的Ⅰ型干擾素mRNA 轉錄水平降低，從而使宿主細胞及機體非特異性免疫功能受到抑制。Zhang H 等［14］研究證實，MiIFN－α抑制水泡性口炎病毒在WISH 細胞上的生長，并且MiIFN－α2可抑制犬瘟熱病毒在Vero細胞上的生長。因此，對干擾素相對表達量的檢測，可間接的對動物感染病毒性疾病的狀態(tài)和機體的免疫活性做出初步評價。

表2 實時熒光定量RT－PCR重復性試驗Table 2 Inter－assay and intra－assay reproducibilities of the real－time RT－PCR

圖5 不同時間點MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γmRNA 的動態(tài)表達Fig.5 Dynamic expression of MiIFN－α，MiIFN－βand MiIFN－γat different times

本研究以GAPDH 基因為內參基因，采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 檢測MiIFN－α、Mi－IFN－β和MiIFN－γ 基因的mRNA 轉錄水平，建立了檢測水貂MiIFN－α、MiIFN－β和MiIFN－γmRNA實時熒光定量RT－PCR 檢測方法。結果4 種基因標準曲線的R2均在0.995～1.000之間，擴增效率較高，標準曲線具有良好的線性關系；由熔解曲線可以看出，無非特異性產物和引物二聚體出現(xiàn)，表明所用的擴增4個基因的引物具有較好的特異性；擴增曲線呈現(xiàn)較好的S 型，檢出下限為10 拷貝重組質粒／μL，敏感性良好；組內、組間重復性試驗顯示變異系數(shù)均小于4.5%，具有較好的重復性。應用本研究建立的檢測方法，對水貂感染腸炎病毒后不同時間外周血淋巴細胞中IFN 的相對變化進行了檢測。結果表明，病毒感染后6d3種IFN 的mRNA水平均達到最高峰值，而感染后4d到6d正是水貂腸炎病毒在水貂體內表達量達到峰值的時段［15］，表明IFN mRNA 水平的改變與病毒感染有著密切的關系，體現(xiàn)出IFN 直接或間接的對病毒感染的抑制作用［16］。經過檢測MiIFN－α相對表達量較MiIFNβ和MiIFN－γ高兩個數(shù)量級，且在病毒感染期（4d～6d）MiIFN－α相對表達量明顯提高，MiIFN－β和MiIFN－γ在病毒感染初期（2d）及感染期（4d～6d）均有兩個峰值，綜上說明MiIFN 與機體抗病毒感染過程有一定的相關性。

本研究建立的水貂MiIFN－α、MiIFN－β和Mi－IFN－γ3種細胞因子實時熒光定量PCR 檢測方法，可以對IFN 在水貂機體內的動態(tài)變化水平進行初步評價，也可以為了解水貂病毒性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸情況及其機體保護性免疫反應動態(tài)規(guī)律提供支持，為水貂IFN mRNA 的定量分析提供了有效工具。

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