孫秋艷，沈美艷

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊261061）

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的高度接觸性傳染病［1－3］。豬場一旦暴發(fā)此病，可造成新生仔豬100%死亡，損失相當(dāng)嚴(yán)重。該病目前尚無有效的治療藥物，采用疫苗免疫接種是主要的預(yù)防措施，但現(xiàn)有TGEV 疫苗在免疫效果和安全性方面存在著一定的缺陷，所以該病只能對(duì)癥治療。應(yīng)用抗生素易產(chǎn)生耐藥性和殘留問題，抗生素殘留不但導(dǎo)致抗藥性的增加，還威脅著人類生命安全，國外將抗生素殘留問題作為一種技術(shù)貿(mào)易壁壘，制約著我國動(dòng)物性食品的出口。因此，研發(fā)天然、低毒、無藥物殘留的綠色生物制劑成為預(yù)防和治療該病的方向之一。

滸苔（Enteromorpha）俗稱苔條、海苔，是綠藻植物石莼科中的水生藻類植物。滸苔作為海域的天然海藻，產(chǎn)量極大，而且大量滸苔生長會(huì)對(duì)海洋環(huán)境造成生態(tài)危害，是成本低廉的綠色植物。滸苔多糖［4］是滸苔的關(guān)鍵活性成分，研究表明滸苔多糖具有抑制皮膚 癌［5］、抗腫瘤［6－7］、降血脂［8］、降 血 糖［9］、抗 氧化［10］、抗細(xì) 菌［11－12］及 免 疫 調(diào) 節(jié) 等 功 能［13－14］。滸 苔 多糖與抗生素相比較具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前對(duì)滸苔多糖的抗病毒功能國內(nèi)外鮮有研究，尤其是滸苔多糖抗TGEV 的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過滸苔多糖對(duì)TGEV 體外抑制作用的研究，為滸苔多糖抗病毒作用和滸苔多糖生物制劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 滸苔多糖的提取 新鮮滸苔（藻體暗綠色，管狀扁壓，中空，主枝明顯，分枝較多，密集且細(xì)長，符合滸苔特征）8 月份采自青島海域，清洗干凈，晾干后按照水煮醇沉法提取［15］：將滸苔研磨至粉末，用電子天平精確稱取粉末加水，100℃煮沸4h，重復(fù)3次；合并3次濾液濃縮，加入3倍量950mL／L 乙醇3 000r／min離心20min；取沉淀加入適量超純水完全溶解，胰蛋白酶消化，Sevage法除蛋白，透析；透析袋內(nèi)液加入950mL／L乙醇至濃度為600mL／L，靜置，離心；沉淀加無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌除脂；得滸苔多糖粗品。用苯酚－硫酸法［16］測得多糖含量為680g／L。高壓滅菌，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 毒株和細(xì)胞 豬傳染性胃腸炎病毒－pudue（TGEV－pudue）株、豬睪丸細(xì)胞（swine testicle cell，ST）均由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物系王玉燕老師惠贈(zèng)。細(xì)胞生長液用含100 mL／L 胎牛血清的DMEM，病毒增殖的維持液為含50mL／L胎牛血清的DMEM。

1.1.3 試劑 DMEM（Gibco）、胎牛血清（Gibco）均購自Invirogen公司；胰蛋白酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TGEV 毒力TCID50的測定 將ST 細(xì)胞［17］進(jìn)行消化傳代，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106個(gè)／mL，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.1 mL，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后，將TGEV 進(jìn)行10×系列稀釋，選取適當(dāng)稀釋度，每一稀釋度接種96孔板中的8孔，每孔0.1 mL，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔24h觀察CPE情況，至96h。按Reed－Muench［18］公式計(jì)算TCID50。

1.2.2 滸苔多糖對(duì)ST 細(xì)胞安全濃度的測定（CPE法） 稱取高壓滅菌滸苔多糖粗品1g加入20 mL細(xì)胞維持液中溶解，用細(xì)胞維持液作2倍連續(xù)倍比稀釋，加到長成單層ST 的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL／孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)8 孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)96h，每隔12h觀察CPE 情況，細(xì)胞病變率的表示方法：“－”表示無細(xì)胞病變；1個(gè)“＋”表示10%細(xì)胞有病變。根據(jù)結(jié)果將滸苔多糖用細(xì)胞維持液稀釋到ST 細(xì)胞安全濃度范圍，再用細(xì)胞維持液對(duì)安全濃度滸苔多糖作2倍連續(xù)倍比稀釋。

1.2.3 滸苔多糖直接殺滅TGEV 作用的測定 選10個(gè)遞增稀釋度倍比稀釋的稀釋液分別與等體積1 000TCID50病毒液混合，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中作用2h和4h，加到長成單層ST 的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL／孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔4h觀察CPE，當(dāng)病毒對(duì)照CPE達(dá)到100%時(shí)，記錄各孔CPE情況。

1.2.4 滸苔多糖抑制TGEV 復(fù)制作用的測定 先將1 000TCID50病毒液接種至長成單層ST 的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1mL／孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中吸附2h和4h，棄去病毒液，加入2倍倍比稀釋的滸苔多糖稀釋液，0.1mL／孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔4h觀察CPE，當(dāng)病毒對(duì)照CPE 達(dá)到100%時(shí)，記錄各孔CPE 情況。

1.2.5 滸苔多糖阻斷TGEV 吸附作用的測定 選取10個(gè)遞增稀釋度的2倍倍比稀釋的滸苔多糖稀釋液加到長成單層ST 的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL／孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)4 孔。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中作用2h和4h，棄去滸苔多糖稀釋液，每孔加入1 000TCID50病毒液0.1mL，37 ℃吸附2h，棄去病毒液，加入維持液，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔4h觀察CPE，當(dāng)病毒對(duì)照CPE達(dá)到100%時(shí)，記錄各孔CPE情況。

2 結(jié)果

2.1 TGEV 毒力TCID50的測定

標(biāo) 準(zhǔn) 毒 株TGEV－pudue 株 在ST 細(xì) 胞 上 的TCID50為10－6.64／0.1mL。

2.2 滸苔多糖對(duì)ST 細(xì)胞安全濃度的測定

根據(jù)96h觀察CPE結(jié)果表明，滸苔多糖粗品稀釋到1.57mg／mL對(duì)ST 細(xì)胞的作用與對(duì)照組無明顯差異，ST 細(xì)胞的形態(tài)均未有明顯改變。因此確定滸苔多糖對(duì)ST 細(xì)胞無毒性濃度小于1.57mg／mL（圖1A 和圖1B）。

圖1 正常的ST 細(xì)胞與感染TGEV 的ST 細(xì)胞（100×）Fig.1 Normal and TGEV infected ST cells（100×）

2.3 滸苔多糖對(duì)直接殺滅TGEV 作用的測定結(jié)果

滸苔多糖對(duì)TGEV 具有直接殺滅作用，在ST細(xì)胞安全濃度范圍內(nèi)，滸苔多糖對(duì)TGEV 直接殺滅作用與滸苔多糖濃度和與TGEV 直接作用的時(shí)間有關(guān)。滸苔多糖濃度越高、與TGEV 作用時(shí)間越長對(duì)TGEV 直接殺滅作用就越明顯，滸苔多糖與TGEV 作用2h的最小殺滅濃度為0.2mg／mL，作用4h的最小殺滅濃度為0.1mg／mL（圖2）。

圖2 滸苔多糖直接殺滅TGEV 作用后ST 細(xì)胞病變率Fig.2 Cytopathic rate of ST cells after of Enteromorpha polysaccharide action to TGEV

2.4 滸苔多糖抑制TGEV 復(fù)制作用的測定結(jié)果

滸苔多糖對(duì)TGEV 復(fù)制的抑制作用效果不甚明顯，但仍有一定效果，在ST 細(xì)胞安全濃度范圍內(nèi)，滸苔多糖對(duì)TGEV 復(fù)制的抑制作用與滸苔多糖濃度和病毒感染細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。滸苔多糖濃度越高效果越明顯，TGEV 感染細(xì)胞時(shí)間越長，滸苔多糖對(duì)其抑制作用越低。滸苔多糖對(duì)TGEV 復(fù)制的抑制作用的最小濃度為1.57mg／mL（圖3）。

圖3 滸苔多糖抑制TGEV 復(fù)制作用的ST 細(xì)胞病變率Fig.3 Cytopathic rate of ST cells after Enteromorpha polysaccharide inhibiting TGEV replication

2.5 滸苔多糖阻斷TGEV 吸附作用的測定

滸苔多糖對(duì)TGEV 吸附ST 細(xì)胞阻斷作用明顯。在ST 細(xì)胞安全濃度范圍內(nèi)，滸苔多糖的濃度越高，滸苔多糖作用于細(xì)胞的時(shí)間越長對(duì)TGEV 阻斷作用越明顯。滸苔多糖對(duì)TGEV 吸附ST 細(xì)胞阻斷作用最小濃度與滸苔多糖作用于ST 細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)，2h 為0.393 mg／mL，4h 為0.2 mg／mL（圖4）。

圖4 滸苔多糖阻斷TGEV 吸附作用ST 細(xì)胞病變率Fig.4 Cytopathic rate of ST cells after Enteromorpha polysaccharide blocking TGEV adsorption

3 討論

滸苔作為海藻的一種，給人們印象最深的不是它的藥用和營養(yǎng)價(jià)值，而是對(duì)海水的污染，大量滸苔漂浮聚集到岸邊，阻塞航道，同時(shí)破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)，嚴(yán)重威脅沿海漁業(yè)、旅游業(yè)發(fā)展。本試驗(yàn)通過水煮醇沉法提取滸苔多糖，并研究滸苔多糖對(duì)TGEV體外抑制作用，是變廢為寶利國利民的事情。滸苔多糖提取采用的是水煮醇沉法，提取出多糖粗品含有很多的雜質(zhì)，有可能對(duì)ST 細(xì)胞具有毒性作用，為了提高滸苔多糖的抗病毒效果還需要優(yōu)化滸苔多糖提取和試驗(yàn)方法。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，滸苔多糖對(duì)TGEV 具有直接殺滅作用，而且多糖濃度越高作用時(shí)間越長，直接殺滅作用越好。滸苔多糖對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)病毒抑制作用不明顯，原因可能是TGEV 進(jìn)入細(xì)胞的速度太快而多糖進(jìn)入細(xì)胞的速度太慢。滸苔多糖對(duì)TGEV 吸附細(xì)胞具有明顯的阻斷作用，因此滸苔多糖對(duì)TGEV 在體外具有一定的抑制作用。本試驗(yàn)初步證實(shí)滸苔多糖有抗病毒的能力，為滸苔多糖在臨床上對(duì)病毒病的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。

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