孫亞琴，王香愛，張 茜

(渭南師范學院 化學與生命科學學院，陜西 渭南 714000)

山藥(Chinese Yam)，又名薯蕷、白薯、土薯、薯藥，為薯蕷科(Dioscoreaceae)植物署蕷(Dioscorea opposite Thunb)的塊莖，為常用中藥，它既可以與其它藥物配用，也是很好的補益食品。據(jù)《神農本草經》記載，山藥具有“主治傷中、補虛贏、除寒熱邪氣，補中益氣力，長肌肉，止泄痢，化痰涎，潤皮毛，益腎氣。久服耳聰目明，經身不饑延年”等功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，山藥含有皂苷、粘液質、膽堿、淀粉、多糖、蛋白質、尿囊素、多種氨基酸、維生素、多巴胺和多種礦物質元素，能誘生干擾素，增強機體免疫力，改善冠狀動脈及微循環(huán)的血流，還具有抗衰老、抗氧化、提高應激力、降血脂、抗腫瘤等功效，是極具營養(yǎng)價值的優(yōu)良食品[1-2]。

黃酮類化合物是山藥的主要活性成分之一，具有多種生物活性，如心血管系統(tǒng)活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫瘤活性、抗氧化自由基活性，抗炎、鎮(zhèn)痛活性，保肝活性，此外，大量研究表明黃酮類化合物還具有降壓、降血脂、抗衰老、提高機體免疫力、瀉下、鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙及抗變態(tài)等藥理活性[3]。

雙水相萃取(aqueous two-phase extraction，ATPE)技術始于20 世紀 60 年代，是利用物質在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異進行萃取的一種新型分離技術[4-5]。因該方法分離條件溫和、過程易放大、生物親和性好等優(yōu)點被廣泛應用[5]。常用的分相鹽主要有(NH4)2SO4、NaNO3、Na2CO3、Na3PO4、Na2SO4、K2HPO4、NaAc或NaCl等，常用的有機相有甲醇、乙醇、丙醇、聚乙二醇(PEG)等。采用此方法提取山藥總黃酮，并研究不同雙水相提取黃酮類化合物的效果，為山藥的開發(fā)利用和發(fā)展先進提取分離技術提供了有益的啟示。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

磷酸氫二鉀:AR，硫酸銨:AR,碳酸鈉:AR，西安化學試劑廠；氯化鈉:AR,硫酸鈉:AR,天津市紅巖化學試劑廠；氫氧化鈉:AR,亞硝酸鈉:AR,成都科龍化學試劑有限公司；硝酸鋁:AR,甲醇:AR,聚乙二醇:AR，相對分子質量3 000，北京化學試劑廠；乙醇:AR,天津化學試劑有限公司；蘆丁標準品:西安化學試劑廠；山藥:購自渭南市臨渭區(qū)。

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上?！憧茖W儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；T6新銳-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 總黃酮的提取

取新鮮山藥洗凈、去皮、切片、低溫烘干、粉碎備用。

1.2.1 乙醇-鹽雙水相提取[6]

取5個小錐形瓶分別加入12 mL水和18 mL無水乙醇使其形成質量分數(shù)60%的乙醇溶液，然后分別加入一定量磷酸氫二鉀、碳酸鈉、硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉固體，邊加邊震蕩使固體溶解，溶液為無色透明液體，直至產生分相為止。再分別加入1 g山藥粉于各雙水相中，60 ℃恒溫水浴提取2 h，抽濾除去山藥渣，濾液于分液漏斗中靜置分層，取上層清液，用分光光度法測定ρ(總黃酮)。

1.2.2 聚乙二醇-鹽雙水相提取[7]

取5個小錐形瓶，分別加入25 mL水及3 g聚乙二醇，搖勻，再分別加入4 g硫酸銨、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、硫酸鈉和9 g氯化鈉(因為加入9 g氯化鈉才分相)，振蕩使固體溶解，靜置，直至產生分相，再分別加入1 g山藥粉，60 ℃恒溫浴提取2 h，抽濾除去山藥渣，濾液于分液漏斗中靜置分層，取上層液，用分光光度法測ρ(總黃酮)。

1.2.3 甲醇-鹽雙水相提取

取5個小錐形瓶分別加入12 mL水和1 g硫酸銨、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、硫酸鈉、氯化鈉固體，然后加入18 mL甲醇，搖勻，靜置分層，再分別加入1 g山藥粉，60 ℃恒溫水浴提取2 h，抽濾除去山藥渣，濾液于分液漏斗中靜置分層，取上層液，用分光光度法測ρ(總黃酮)。

1.3 ρ(總黃酮)的測定

參考文獻[8]方法繪制蘆丁標準曲線。

對照品溶液的制備：準確稱取蘆丁對照品0.006 0 g，用體積分數(shù)30%乙醇溶液將蘆丁溶解，定容到100 mL容量瓶中，搖勻。

標準曲線的繪制：準確吸取0.06 mg/mL 蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL，分別置于50 mL 容量瓶中，各加質量分數(shù)5%的NaNO2溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加質量分數(shù)10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加質量分數(shù)4%的 NaOH 溶液10 mL，再加質量分數(shù)30%的乙醇溶液至刻度，搖勻，放置15 min。按照分光光度法在510 nm 波長處，以試劑空白作參比測定吸光度，根據(jù)測定的不同質量濃度蘆丁對照品溶液的吸光度，繪制出蘆丁標準曲線圖，得回歸方程。

提取物中ρ(黃酮)以ρ(總黃酮)計算，以蘆丁為標準，參照繪制蘆丁標準曲線的方法，在總黃酮提取液中加入Al(NO3)3溶液，使黃酮化合物與鋁鹽形成穩(wěn)定的有色絡合物，在波長510 nm 處測定吸光度，用標準曲線法計算ρ(總黃酮)。準確吸取上層提取液2.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，對照組加入蒸餾水2.0 mL，依次各加質量分數(shù)5%的NaNO2溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加質量分數(shù)10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加質量分數(shù)4%的NaOH溶液10 mL，再加質量分數(shù)30%的乙醇溶液至刻度，搖勻，放置15 min。按照分光光度法在510 nm波長處，以試劑空白作參比測定吸光度。通過回歸方程計算出ρ(總黃酮)。總黃酮提取率按下式計算。

提取率=總黃酮質量/樣品質量[9]

2 結果與討論

2.1 標準曲線

以蘆丁對照品的ρ(蘆丁)為橫坐標，以在510 nm下測得不同的ρ(蘆丁)對照品的吸光度為縱坐標，繪制的標準曲線，見圖1。

ρ(蘆丁)/(mg·L-1)圖1 蘆丁標準曲線

對圖1的數(shù)據(jù)進行線性回歸得蘆丁對照品吸光度(A)和濃度(ρ)的方程為：A=0.013 3ρ-0.002 6，R2=1.000 0，線性關系良好。

2.2 各雙水相提取山藥ρ(總黃酮)

各雙水相提取山藥ρ(總黃酮)見表1～表3。

表1 乙醇-鹽雙水相提取的ρ(總黃酮)

表2 甲醇-鹽雙水相提取的ρ(總黃酮)

表3聚乙二醇-鹽雙水相提取的ρ(總黃酮)

鹽 K2HPO4Na2CO3(NH3)2SO4NaCl Na2SO4吸光度9.92188.40967.66627.00344.9144ρ(總黃酮) /(mg·mL-1)0.74620.63250.57660.52680.3697 提取率/%3.73103.16252.88302.63401.8485

由表1、表2、表3可知堿式或酸式鹽形成的雙水相提取效果比中性鹽的提取效果要好?？赡苁且驗閴A式或酸式鹽可水解，與水的結合能力較強，且磷酸氫二鉀、碳酸鈉和硫酸銨在60 ℃時的實際溶解度也比后2種鹽大，從而使兩相分離的較為明顯，提取效果較好。而在前3種鹽中，磷酸氫二鉀在60 ℃的溶解度最大，同時磷酸氫二鉀是高價鹽其鹽析作用較強，提取效果更好一些。

由表1、表2、表3對比可知，聚合物形成的雙水相比低分子有機化合物形成的雙水相提取效果較好。可能是因為低分子有機化合物如甲醇、乙醇，與水的親和能力較強，而不易形成雙水相，且在低溫加熱時甲醇、乙醇易揮發(fā)，從而導致提取效果不太好。用高聚物如聚乙二醇形成雙水相，可避免上述缺點，而且操作方便。

由以上分析可知山藥中含有豐富的黃酮類化合物，用聚乙二醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取山藥總黃酮效果最好，測得樣品中ρ(總黃酮) =0.746 2 mg/mL，提取率為3.731 0%。

3 結 論

研究了常用的幾種雙水相提取山藥總黃酮的提取效果，其中在60 ℃時用聚乙二醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取山藥總黃酮效果最好，測得樣品中ρ(總黃酮)=0.746 2 mg/mL，提取率為3.731 0%。

雙水相萃取技術在微生物、有機化合物的分離和純化等過程中表現(xiàn)出相當好的性能。其和傳統(tǒng)的分離方法(如回流法、鹽析、沉淀、有機溶劑萃取等)相比其優(yōu)勢在于實驗設備簡單、溶劑用量少、幾乎不存在有機溶劑殘留、分相時間短、分離條件溫和、萃取時間短，還避免了超聲波、微波等對人體的傷害，并有望用于大規(guī)模提取和純化生物活性物質，因此有很好的應用前景。但仍有一些未能解決的問題，例如雙水相的形成機理和活性物質在兩相體系間的分配機理尚未完全研究清楚，因此還需對該技術投入大量的研究。

[ 參 考 文 獻 ]

[1] 張婧萱,廖保寧,黃鎖義.淮山藥中總黃酮的提取及對羥基自由基的清除作用[J].微量元素與健康研究,2007,24(1)：44-54.

[2] 趙宏,謝曉玲,萬金志,等.山藥的化學成分及藥理研究進展[J].今日藥學,2009,19(3)：49-52.

[3] 劉寧,朱沛沛,李嘉樂.黃酮類化合物提取工藝研究進展[J].飲料工業(yè),2012,15(7)：7-9.

[4] 侯彩霞,姚煥方,全燦.黃酮類天然產物功效成分提取和純化技術的研究進展[J].上?；?2012,37(6)：27-31.

[5] 郭輝,張中玉,羅宇倩,等.雙水相萃取法分離竹葉黃酮的工藝研究[J].氨基酸和生物資源,2012,34(2)：24-28.

[6] 顧玉娟,彭秧.乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系萃取測定椒蒿中總黃酮的含量[J].中國釀造,2012,31(8)：156-158.

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[8] 陳利梅.超聲波輔助雙水相提取條斑紫菜黃酮類物質及其抗氧化活性研究[J].食品科學,2012,33(4)：41-46.

[9] 張敏娜,朱軍,王光輝,等.雙水相體系與超聲集成提取月季花總黃酮[J].上海醫(yī)藥,2012,33(3)：29-30.