晉學(xué)飛等

摘 要 通過分離人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）中基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）基因序列，利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)并純化了包涵體復(fù)性的MMP1；采用融合表達(dá)硫氧還蛋白（Thioredoxin，TrxA）的方法獲得了可溶性的MMP1TrxA復(fù)合蛋白，在TrxA蛋白和MMP1活性中心之間引入了一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)，通過酶切作用獲得可溶性MMP1。明膠酶譜分析法對(duì)體外表達(dá)的MMP1和體內(nèi)（尿液中）MMP1進(jìn)行了分析比較。結(jié)果表明，TrxA蛋白能夠顯著提高M(jìn)MP1的可溶性，且可溶性MMP1的明膠降解活性是復(fù)性的MMP1降解活性的 1.54倍，與尿液中的MMP1的明膠酶降解活性相當(dāng)。因此，明膠酶譜法是一種有效的、高靈敏的MMP1檢測(cè)方法，所表達(dá)的可溶性MMP1為小分子探針篩選提供了更可靠的分子靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 膀胱癌生物標(biāo)志物； 基質(zhì)金屬蛋白酶； 分子探針篩選； 明膠酶譜

1 引 言

目前，由膀胱癌引起的男性致死率處于上升趨勢(shì)。盡管對(duì)膀胱癌的診斷和治療技術(shù)已有了很大提高，但膀胱癌患者的生存率仍然不佳，迫切需要針對(duì)膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的診斷技術(shù)[1]。尋找新型膀胱癌標(biāo)志物，開發(fā)非侵入性、高敏感性和特異性、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉的檢測(cè)技術(shù)，將提高膀胱癌的早期診斷水平，達(dá)到及時(shí)治療的目的[2，3]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）也被稱為間質(zhì)膠原酶和成纖維細(xì)胞膠原酶，同腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān)，在胰腺癌、前列腺癌、大腸癌和乳腺癌中的表達(dá)都有升高[4，5]。有研究表明： 在膀胱癌患者尿液中，MMP1可以作為新型生物標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)患者是否會(huì)發(fā)展為晚期或者高級(jí)膀胱癌[6，7]。目前，臨床主要使用酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）對(duì)尿液樣本中的MMP1進(jìn)行檢測(cè)，但該方法耗時(shí)、尿樣制備復(fù)雜，容易導(dǎo)致蛋白降解以及蛋白酶失活。因此，在膀胱癌診斷過程中迫切需要針對(duì)MMP1檢測(cè)的簡(jiǎn)單、靈敏、快速的檢測(cè)技術(shù)。

對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的體外和體內(nèi)檢測(cè)方法主要有小分子熒光探針、免疫印跡分析和ELISA等[8～10]，但是免疫印跡方法成本較高， 需要靶蛋白特異性抗體、內(nèi)參抗體以及二抗，檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且一次檢測(cè)的通量有限。Wigner等[11]利用小分子熒光探針快速檢測(cè)了尿液中MMP9和MMP13的水平。該方法將MMPs的活性同熒光檢測(cè)技術(shù)巧妙結(jié)合，具有高敏感性、快速、方便等特點(diǎn)，適合不同生物樣本的分析，特別適合MMPs的高通量檢測(cè)。目前，尚沒有適用于MMP1的小分子探針檢測(cè)方法。Kleiner等[12]建立了一種基于非還原SDSPAGE電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，即明膠酶譜法，該方法成本低、簡(jiǎn)單， 適合血漿、組織細(xì)胞蛋白提取物或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等多種生物樣本的分析，靈敏度與小分子熒光探針法相當(dāng)[13]。Roy等[14]將明膠酶譜進(jìn)一步運(yùn)用到尿液檢測(cè)中，并建立了一個(gè)基于不同尿液中MMP9活性指紋圖譜進(jìn)行分類的腫瘤分析鑒定方法。

重組蛋白表達(dá)是小分子熒光探針篩選的基礎(chǔ)，獲得天然構(gòu)象的重組蛋白一直是探針篩選過程的重點(diǎn)與難點(diǎn)，利用明膠酶譜法可以對(duì)重組蛋白與內(nèi)源蛋白進(jìn)行評(píng)估，以改進(jìn)和加快分子探針的篩選進(jìn)程?？扇苄灾亟M蛋白較包涵體復(fù)性蛋白更接近其天然構(gòu)象，而MMP1蛋白在大腸桿菌中重組表達(dá)很容易形成包涵體，需要進(jìn)行包涵體復(fù)性來獲得活性蛋白。文獻(xiàn)＼[15＼]采用特殊處理方法增加MMP1的可溶性表達(dá)，但是并沒有分析可溶性MMP1同包涵體復(fù)性MMP1的區(qū)別以及同內(nèi)源MMP1的關(guān)系。本研究嘗試不同的表達(dá)載體，最終實(shí)現(xiàn)通過融合表達(dá)硫氧還蛋白（Thioredoxin，TrxA）的方法獲得可溶性的MMP1，并利用明膠酶譜法對(duì)體外表達(dá)的可溶性以及包涵體復(fù)性的MMP1進(jìn)行了對(duì)比。研究結(jié)果證明， TrxA可以明顯提高M(jìn)MP1的溶解性；同包涵體復(fù)性的MMP1相比，可溶性MMP1具有更高的明膠降解活性，更接近體內(nèi)MMP1的活性。本研究為MMP1的小分子探針篩選提供了更可靠的分子靶點(diǎn)，證明了明膠酶譜法是一種有效的、高靈敏的MMP1檢測(cè)方法。

3.2 重組MMP1的體外表達(dá)

通過包涵體復(fù)性的方法獲得活性MMP1的研究已有很多報(bào)道，而關(guān)于可溶性表達(dá)MMP1的報(bào)導(dǎo)則很少[14]。本研究在載體pET28a中表達(dá)含有His標(biāo)簽的MMP1催化結(jié)構(gòu)域蛋白（MMP1His6）。結(jié)果表明，在37 ℃下，1 mmol/L IPTG可以誘導(dǎo)MMP1His6包涵體的形成。并且在4 h內(nèi)，包涵體蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。同時(shí)在pET32a′載體中表達(dá)MMP1融合蛋白（TRXMMP1）。同MMP1His6相比較，TRXMMP1在MMP1His6之前含有TrxA蛋白，并且在TrxA和MMP1之間有一個(gè)腸激酶酶切位點(diǎn)。在25 ℃下，0.4 mmol/L IPTG可以誘導(dǎo)可溶性TRXMMP1的表達(dá)，但是表達(dá)量在2 h后達(dá)到最大值（圖2）。SDSPAGE電泳結(jié)果表明， MMP1His6存在于菌體總蛋白中，而不存在于細(xì)胞裂解液上清液中，而TRXMMP1在細(xì)菌總蛋白和細(xì)胞裂解液的上清液中都存在（圖3）。上述研究表明，TRXMMP1是以可溶形式表達(dá)的，而MMP1His6是以包涵體形式表達(dá)的，TrxA能夠增加MMP1的可溶性表達(dá)，并且可溶性的TRXMMP1表達(dá)同包涵體MMP1His6相比，所需的誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG誘導(dǎo)劑量均不相同。

3.3 MMP1純化及明膠酶譜活性分析

MMP1His6和TRXMMP1的C末端都含有His標(biāo)簽，可以通過鎳離子螯合層析純化。利用8 mol/L尿素溶液溶解MMP1His6包涵體，將包涵體溶解液進(jìn)行鎳離子螯合層析，用含100 mmol/L的咪唑的洗脫液洗脫MMP1His6蛋白，通過透析復(fù)性獲得20 kDa大小的復(fù)性MMP1蛋白（圖4， 泳道3）。可溶性MMP1（TRXMMP1）蛋白則表達(dá)在菌液裂解上清液中，將裂解上清液循環(huán)上樣，通過鎳離子螯合層析柱純化出30 kDa的TRXMMP1融合蛋白（圖4，泳道1）。融合蛋白TRXMMP1在TrxA標(biāo)簽蛋白和MMP1蛋白之間包含一個(gè)腸激酶酶切位點(diǎn)，通過腸激酶裂解后，TRXMMP1中10 kDa的TrxA標(biāo)簽蛋白以及可溶性MMP1（圖4A，泳道2）通過鎳離子螯合層析分離純化。結(jié)果表明，純化的可溶性MMP1同包涵體復(fù)性的MMP1具有相同的分子量大?。▓D4，泳道2和泳道3）。對(duì)純化的融合蛋白TRXMMP1和可溶性MMP1進(jìn)行明膠酶譜分析，表明兩者都具有明膠降解活性（圖4，泳道4和泳道5），而分離的TrxA標(biāo)簽并不含有明膠降解活性。同時(shí)，對(duì)可溶性MMP1和包涵體復(fù)性的MMP1活性進(jìn)行明膠酶譜比較（圖4，泳道5和泳道6及圖5）。結(jié)果表明，可溶性MMP1的明膠降解活性為復(fù)性MMP1的1.54倍（明膠降解比率分別為22.2%和14.4%）。由于尿液中存在MMP2和MMP9，會(huì)干擾明膠酶譜的結(jié)果，通過超濾離心收集尿液中的MMP1組分，并移除尿液中高分子量50 kDa以上的蛋白組分（MMP2和MMP9組分）。結(jié)果表明，sMMP1的明膠降解活性幾乎與體內(nèi)MMP1的明膠降解活性一致（明膠降解比率分別為22.2%和25%）。這些結(jié)果表明，可以通過融合TrxA蛋白實(shí)現(xiàn)MMP1在體外的可溶性表達(dá)，并且可溶性MMP1相對(duì)于包涵體復(fù)性的MMP1蛋白更高的明膠降解活性，接近體內(nèi)MMP1的明膠降解活性。endprint

4 結(jié) 論

本研究利用TrxA實(shí)現(xiàn)了MMP1在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，并利用明膠酶譜法比較了體外表達(dá)的MMP1和體內(nèi)MMP1的活性，結(jié)果表明，可溶性的MMP1活性高于包涵體復(fù)性MMP1，更接近體內(nèi)MMP1的活性。結(jié)果表明， 可溶性的MMP1較包涵體復(fù)性的MMP1在小分子探針篩選中具有更大的優(yōu)勢(shì)，可為針對(duì)MMP1檢測(cè)的小分子探針篩選提供更可靠的分子靶點(diǎn)。

References

1 Wood S L， Knowles M A， Thompson D， Selby P J， Banks R E. Nat. Rev. Urol.， 2013， 10（4）： 206-218

2 GAO Yuan， QIAO GuangMing， LI Na， GAO LinHai， TANG Bo. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（12）： 1926-1931

高 源， 喬光明， 李 娜， 禚林海， 唐 波. 分析化學(xué)， 2011， 39（12）： 1926-1931

3 Liao D， Li W， Chen J， Jiao H， Zhou H， Wang B， Yu C. Anal. Chim. Acta， 2013， 797： 89-94

4 Bostrom P， Soderstrom M， Vahlberg T， Soderstrom K， Roberts P， Carpen O， Hirsimaki P. BMC Cancer， 2011， 11： 348

5 LIU XingChen， LI HongWei， WANG Ye， JIANG Kun， FANG XueXun， WU YuQing. Chem. J. Chinese Universities， 2010， 31（1）： 88-93

劉星辰， 李洪偉， 王 燁， 蔣 坤， 房學(xué)迅， 吳玉清. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 31（1）： 88-93

6 Durkan G， Nutt J， Rajjayabun P， Neal D， Lunec J， Mellon J. Clin. Cancer Res.， 2001， 7（11）： 3450-3456

7 ZHU FengYing， YU AiNa， QIU YiHong， SA YingLong， WANG Fu. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（8）： 1132-1136

朱鳳英， 虞愛娜， 邱意弘， 撒應(yīng)龍， 王 復(fù). 分析化學(xué)， 2007， 35（8）： 1132-1136

8 Lombard C， Saulnier J， Wallach J. Biochimie， 2005， 87（34）： 265-272

9 Kupai K， Szucs G， Cseh S， Hajdu I， Csonka C， Csont T， Ferdinandy P. J. Pharmacol. Toxicol. Met.， 2010， 61（2）： 205-209

10 Wang Y， Shen P， Li C， Wang Y， Liu Z. Anal. Chem.， 2012， 84（3）： 1466-1473

11 Wigner N A， Kulkarni N， Yakavonis M， Young M， Tinsley B， Meeks B， Einhorn T A， Gerstenfeld L C. Injury， 2012， 43（3）： 274-278

12 Kleiner D E， StetlerStevenson W G. Anal. Biochem.， 1994， 218（2）： 325-329

13 Hughes A J， Herr A E. Anal. Chem.， 2010， 82（9）： 3803-3811

14 Roy R， Louis G， Loughlin K， Wiederschain D， Kilroy S， Lamb C， Zurakowski D， Moses M. Clinical Cancer Research， 2008， 14： 6610-6617

15 Lu W， Zhu J， Zou S， Li X， Huang J. J Enzyme Inhib. Med. Chem.， 2013， 28（4）： 741-746endprint