晉學(xué)飛等
摘 要 通過分離人胚胎腎細胞(HEK293)中基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)基因序列,利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達并純化了包涵體復(fù)性的MMP1;采用融合表達硫氧還蛋白(Thioredoxin,TrxA)的方法獲得了可溶性的MMP1TrxA復(fù)合蛋白,在TrxA蛋白和MMP1活性中心之間引入了一個腸激酶切割位點,通過酶切作用獲得可溶性MMP1。明膠酶譜分析法對體外表達的MMP1和體內(nèi)(尿液中)MMP1進行了分析比較。結(jié)果表明,TrxA蛋白能夠顯著提高MMP1的可溶性,且可溶性MMP1的明膠降解活性是復(fù)性的MMP1降解活性的 1.54倍,與尿液中的MMP1的明膠酶降解活性相當。因此,明膠酶譜法是一種有效的、高靈敏的MMP1檢測方法,所表達的可溶性MMP1為小分子探針篩選提供了更可靠的分子靶點。
關(guān)鍵詞 膀胱癌生物標志物; 基質(zhì)金屬蛋白酶; 分子探針篩選; 明膠酶譜
1 引 言
目前,由膀胱癌引起的男性致死率處于上升趨勢。盡管對膀胱癌的診斷和治療技術(shù)已有了很大提高,但膀胱癌患者的生存率仍然不佳,迫切需要針對膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的診斷技術(shù)[1]。尋找新型膀胱癌標志物,開發(fā)非侵入性、高敏感性和特異性、操作簡便、費用低廉的檢測技術(shù),將提高膀胱癌的早期診斷水平,達到及時治療的目的[2,3]。
基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)也被稱為間質(zhì)膠原酶和成纖維細胞膠原酶,同腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān),在胰腺癌、前列腺癌、大腸癌和乳腺癌中的表達都有升高[4,5]。有研究表明: 在膀胱癌患者尿液中,MMP1可以作為新型生物標志物,用于預(yù)測患者是否會發(fā)展為晚期或者高級膀胱癌[6,7]。目前,臨床主要使用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)對尿液樣本中的MMP1進行檢測,但該方法耗時、尿樣制備復(fù)雜,容易導(dǎo)致蛋白降解以及蛋白酶失活。因此,在膀胱癌診斷過程中迫切需要針對MMP1檢測的簡單、靈敏、快速的檢測技術(shù)。
對基質(zhì)金屬蛋白酶的體外和體內(nèi)檢測方法主要有小分子熒光探針、免疫印跡分析和ELISA等[8~10],但是免疫印跡方法成本較高, 需要靶蛋白特異性抗體、內(nèi)參抗體以及二抗,檢測費時費力,且一次檢測的通量有限。Wigner等[11]利用小分子熒光探針快速檢測了尿液中MMP9和MMP13的水平。該方法將MMPs的活性同熒光檢測技術(shù)巧妙結(jié)合,具有高敏感性、快速、方便等特點,適合不同生物樣本的分析,特別適合MMPs的高通量檢測。目前,尚沒有適用于MMP1的小分子探針檢測方法。Kleiner等[12]建立了一種基于非還原SDSPAGE電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,即明膠酶譜法,該方法成本低、簡單, 適合血漿、組織細胞蛋白提取物或細胞培養(yǎng)上清液等多種生物樣本的分析,靈敏度與小分子熒光探針法相當[13]。Roy等[14]將明膠酶譜進一步運用到尿液檢測中,并建立了一個基于不同尿液中MMP9活性指紋圖譜進行分類的腫瘤分析鑒定方法。
重組蛋白表達是小分子熒光探針篩選的基礎(chǔ),獲得天然構(gòu)象的重組蛋白一直是探針篩選過程的重點與難點,利用明膠酶譜法可以對重組蛋白與內(nèi)源蛋白進行評估,以改進和加快分子探針的篩選進程。可溶性重組蛋白較包涵體復(fù)性蛋白更接近其天然構(gòu)象,而MMP1蛋白在大腸桿菌中重組表達很容易形成包涵體,需要進行包涵體復(fù)性來獲得活性蛋白。文獻\[15\]采用特殊處理方法增加MMP1的可溶性表達,但是并沒有分析可溶性MMP1同包涵體復(fù)性MMP1的區(qū)別以及同內(nèi)源MMP1的關(guān)系。本研究嘗試不同的表達載體,最終實現(xiàn)通過融合表達硫氧還蛋白(Thioredoxin,TrxA)的方法獲得可溶性的MMP1,并利用明膠酶譜法對體外表達的可溶性以及包涵體復(fù)性的MMP1進行了對比。研究結(jié)果證明, TrxA可以明顯提高MMP1的溶解性;同包涵體復(fù)性的MMP1相比,可溶性MMP1具有更高的明膠降解活性,更接近體內(nèi)MMP1的活性。本研究為MMP1的小分子探針篩選提供了更可靠的分子靶點,證明了明膠酶譜法是一種有效的、高靈敏的MMP1檢測方法。
3.2 重組MMP1的體外表達
通過包涵體復(fù)性的方法獲得活性MMP1的研究已有很多報道,而關(guān)于可溶性表達MMP1的報導(dǎo)則很少[14]。本研究在載體pET28a中表達含有His標簽的MMP1催化結(jié)構(gòu)域蛋白(MMP1His6)。結(jié)果表明,在37 ℃下,1 mmol/L IPTG可以誘導(dǎo)MMP1His6包涵體的形成。并且在4 h內(nèi),包涵體蛋白表達量隨著時間的延長而增加。同時在pET32a′載體中表達MMP1融合蛋白(TRXMMP1)。同MMP1His6相比較,TRXMMP1在MMP1His6之前含有TrxA蛋白,并且在TrxA和MMP1之間有一個腸激酶酶切位點。在25 ℃下,0.4 mmol/L IPTG可以誘導(dǎo)可溶性TRXMMP1的表達,但是表達量在2 h后達到最大值(圖2)。SDSPAGE電泳結(jié)果表明, MMP1His6存在于菌體總蛋白中,而不存在于細胞裂解液上清液中,而TRXMMP1在細菌總蛋白和細胞裂解液的上清液中都存在(圖3)。上述研究表明,TRXMMP1是以可溶形式表達的,而MMP1His6是以包涵體形式表達的,TrxA能夠增加MMP1的可溶性表達,并且可溶性的TRXMMP1表達同包涵體MMP1His6相比,所需的誘導(dǎo)時間和IPTG誘導(dǎo)劑量均不相同。
3.3 MMP1純化及明膠酶譜活性分析
MMP1His6和TRXMMP1的C末端都含有His標簽,可以通過鎳離子螯合層析純化。利用8 mol/L尿素溶液溶解MMP1His6包涵體,將包涵體溶解液進行鎳離子螯合層析,用含100 mmol/L的咪唑的洗脫液洗脫MMP1His6蛋白,通過透析復(fù)性獲得20 kDa大小的復(fù)性MMP1蛋白(圖4, 泳道3)??扇苄訫MP1(TRXMMP1)蛋白則表達在菌液裂解上清液中,將裂解上清液循環(huán)上樣,通過鎳離子螯合層析柱純化出30 kDa的TRXMMP1融合蛋白(圖4,泳道1)。融合蛋白TRXMMP1在TrxA標簽蛋白和MMP1蛋白之間包含一個腸激酶酶切位點,通過腸激酶裂解后,TRXMMP1中10 kDa的TrxA標簽蛋白以及可溶性MMP1(圖4A,泳道2)通過鎳離子螯合層析分離純化。結(jié)果表明,純化的可溶性MMP1同包涵體復(fù)性的MMP1具有相同的分子量大?。▓D4,泳道2和泳道3)。對純化的融合蛋白TRXMMP1和可溶性MMP1進行明膠酶譜分析,表明兩者都具有明膠降解活性(圖4,泳道4和泳道5),而分離的TrxA標簽并不含有明膠降解活性。同時,對可溶性MMP1和包涵體復(fù)性的MMP1活性進行明膠酶譜比較(圖4,泳道5和泳道6及圖5)。結(jié)果表明,可溶性MMP1的明膠降解活性為復(fù)性MMP1的1.54倍(明膠降解比率分別為22.2%和14.4%)。由于尿液中存在MMP2和MMP9,會干擾明膠酶譜的結(jié)果,通過超濾離心收集尿液中的MMP1組分,并移除尿液中高分子量50 kDa以上的蛋白組分(MMP2和MMP9組分)。結(jié)果表明,sMMP1的明膠降解活性幾乎與體內(nèi)MMP1的明膠降解活性一致(明膠降解比率分別為22.2%和25%)。這些結(jié)果表明,可以通過融合TrxA蛋白實現(xiàn)MMP1在體外的可溶性表達,并且可溶性MMP1相對于包涵體復(fù)性的MMP1蛋白更高的明膠降解活性,接近體內(nèi)MMP1的明膠降解活性。endprint
4 結(jié) 論
本研究利用TrxA實現(xiàn)了MMP1在大腸桿菌中的可溶性表達,并利用明膠酶譜法比較了體外表達的MMP1和體內(nèi)MMP1的活性,結(jié)果表明,可溶性的MMP1活性高于包涵體復(fù)性MMP1,更接近體內(nèi)MMP1的活性。結(jié)果表明, 可溶性的MMP1較包涵體復(fù)性的MMP1在小分子探針篩選中具有更大的優(yōu)勢,可為針對MMP1檢測的小分子探針篩選提供更可靠的分子靶點。
References
1 Wood S L, Knowles M A, Thompson D, Selby P J, Banks R E. Nat. Rev. Urol., 2013, 10(4): 206-218
2 GAO Yuan, QIAO GuangMing, LI Na, GAO LinHai, TANG Bo. Chinese J. Anal. Chem., 2011, 39(12): 1926-1931
高 源, 喬光明, 李 娜, 禚林海, 唐 波. 分析化學(xué), 2011, 39(12): 1926-1931
3 Liao D, Li W, Chen J, Jiao H, Zhou H, Wang B, Yu C. Anal. Chim. Acta, 2013, 797: 89-94
4 Bostrom P, Soderstrom M, Vahlberg T, Soderstrom K, Roberts P, Carpen O, Hirsimaki P. BMC Cancer, 2011, 11: 348
5 LIU XingChen, LI HongWei, WANG Ye, JIANG Kun, FANG XueXun, WU YuQing. Chem. J. Chinese Universities, 2010, 31(1): 88-93
劉星辰, 李洪偉, 王 燁, 蔣 坤, 房學(xué)迅, 吳玉清. 高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報, 2010, 31(1): 88-93
6 Durkan G, Nutt J, Rajjayabun P, Neal D, Lunec J, Mellon J. Clin. Cancer Res., 2001, 7(11): 3450-3456
7 ZHU FengYing, YU AiNa, QIU YiHong, SA YingLong, WANG Fu. Chinese J. Anal. Chem., 2007, 35(8): 1132-1136
朱鳳英, 虞愛娜, 邱意弘, 撒應(yīng)龍, 王 復(fù). 分析化學(xué), 2007, 35(8): 1132-1136
8 Lombard C, Saulnier J, Wallach J. Biochimie, 2005, 87(34): 265-272
9 Kupai K, Szucs G, Cseh S, Hajdu I, Csonka C, Csont T, Ferdinandy P. J. Pharmacol. Toxicol. Met., 2010, 61(2): 205-209
10 Wang Y, Shen P, Li C, Wang Y, Liu Z. Anal. Chem., 2012, 84(3): 1466-1473
11 Wigner N A, Kulkarni N, Yakavonis M, Young M, Tinsley B, Meeks B, Einhorn T A, Gerstenfeld L C. Injury, 2012, 43(3): 274-278
12 Kleiner D E, StetlerStevenson W G. Anal. Biochem., 1994, 218(2): 325-329
13 Hughes A J, Herr A E. Anal. Chem., 2010, 82(9): 3803-3811
14 Roy R, Louis G, Loughlin K, Wiederschain D, Kilroy S, Lamb C, Zurakowski D, Moses M. Clinical Cancer Research, 2008, 14: 6610-6617
15 Lu W, Zhu J, Zou S, Li X, Huang J. J Enzyme Inhib. Med. Chem., 2013, 28(4): 741-746endprint