楊紹斌,趙 瑩,孫慧珍,陳玉波

(沈陽大學 生命科學與工程學院,遼寧 沈陽 110044)

KI溶液對冬蟲夏草生物量及多糖含量的影響

楊紹斌,趙 瑩,孫慧珍,陳玉波

(沈陽大學 生命科學與工程學院,遼寧 沈陽 110044)

研究不同濃度KI溶液對冬蟲夏草液體發(fā)酵液中蟲草生物量和蟲草多糖含量的影響,篩選出提高蟲草生物量及蟲草多糖含量的最優(yōu)KI濃度.將不同濃度的KI溶液添加到蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,測定蟲草生物量,提取蟲草多糖,用苯酚-硫酸法對其含量進行檢測.結(jié)果表明,在冬蟲夏草液體發(fā)酵液中,添加KI溶液能明顯提高蟲草生物量及蟲草多糖含量,當KI質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,蟲草生物量質(zhì)量濃度達31.64 mg/mL,菌絲體長勢很強,胞內(nèi)多糖含量為26.4 mg/g,胞外多糖質(zhì)量濃度為3.6 mg/mL,為最優(yōu)濃度梯度.冬蟲夏草發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加KI溶液能明顯提高蟲草生物量及蟲草多糖含量.

冬蟲夏草; KI; 發(fā)酵培養(yǎng); 生物量; 蟲草多糖

冬蟲夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)屬真菌門(Eumycota)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、核菌綱(pyrenomyerees)、麥角菌目(Clavieipitales)、麥角菌科(Clavieipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps),寄生于蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)幼蟲上,主要分布在四川、青海、西藏等地,是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材.冬蟲夏草含有蟲草多糖、蟲草素、核苷類物質(zhì)、麥角甾醇、蟲草酸、蛋白質(zhì)、SOD、氨基酸、維生素、多種微量元素及類胡蘿卜素等多種有效成分[1].其富含蟲草多糖(Polysaccharides from cultured mycelium ofCordycepssinensis,PCS),能降低胰島素抵抗指數(shù),減輕β細胞的負荷,具有胰島素增敏作用[2-3].并且其味甘性平,以全草入藥,具有非常重要的藥用價值以及廣泛的藥理作用.由于冬蟲夏草生長條件苛刻,天然資源匱乏,因此科技人員將研究開發(fā)的重點放在冬蟲夏草的菌種培養(yǎng)上.但是在菌種發(fā)酵過程中,冬蟲夏草菌絲體極易被氧化,影響菌絲體產(chǎn)量及多種有效成分的產(chǎn)率,目前有多種方法提高菌絲體產(chǎn)量及蟲草多糖產(chǎn)率的方法,只是從抗氧化角度著手研究和開發(fā)其功效的尚少,在冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抗氧化KI溶液的效果鮮為人知.在液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中,如何高效利用這一方法提高培養(yǎng)基的抗氧化性,提高冬蟲夏草菌的產(chǎn)率,已成為亟待解決的問題.目前,有關液體培養(yǎng)時添加KI溶液對蟲草生物量和蟲草多糖含量的影響還未見報道,筆者進行了該研究[4-5].

本研究將9個濃度梯度的KI溶液添加到冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,通過對照實驗和顯著性測定,篩選出提高蟲草生物量及蟲草多糖含量的最優(yōu)KI濃度,從而有效提高冬蟲夏草的菌絲體生物量及蟲草多糖含量,并且進行優(yōu)化蟲草液體培養(yǎng)實驗,對蟲草產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有一定的理論與實踐意義[6].

1 材 料

1.1 供試菌株

冬蟲夏草菌種(Hirsutellasinensis),由中國科學院微生物研究所提供,于沈陽大學重點實驗室低溫保存.

馬鈴薯、葡萄糖、大豆粉、蠶蛹粉、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、維生素B1、瓊脂、蔗糖、牛肉膏、95%乙醇.其他試劑為國產(chǎn)分析純.

1.2 主要儀器

DHC-9146電熱恒溫鼓風干燥箱、DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗制備有限公司);PB-10pH計(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);Lab Alliance 3500G高效液相色譜儀(美國SSI公司);SW-GJ-2FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);681磁力加熱攪拌器(上海南匯電訊器材廠);高速冷凍離心機(美國科峻儀器公司);HZS-H型水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子開發(fā)有限公司);RE5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器有限公司);PB203-N電子天平(深圳市怡華新電子有限公司);FW177中草藥粉碎機(天津泰斯特有限責任公司);721分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司).

2 實驗方法

2.1 培養(yǎng)基設計

(1) 斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,牛肉膏10 g,蠶蛹粉10 g,蛋白胨10 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O1.5 g,維生素B110 mg,瓊脂20 g,水1 000 mL.

(2) 種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,牛肉膏10 g,蛋白胨10 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O1.5 g,維生素B110 mg,水1 000 mL.

(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基:配方見表1.

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方表Table1 Component of fermentation medium

2.2 接種培養(yǎng)

2.2.1 菌種的活化.將冷凍保藏的菌種無菌操作接種到斜面培養(yǎng)基中,27 ℃無光培養(yǎng),斜面上菌絲潔白旺盛并無雜菌時待用.

2.2.2 種子培養(yǎng)液的制備.先將制備好的斜面培養(yǎng)基上的母種用接種鏟取一塊約20 mm2大小的菌苔接入種子培養(yǎng)基(裝樣量為50 mL/100 mL三角瓶)中,在27 ℃、130 r/min恒溫振蕩器上無光培養(yǎng)180 h,形成微小的菌球.

2.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng).在100 mL三角瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液,每種配方KI溶液的添加量按培養(yǎng)基設計濃度梯度添加,配方一(對照組)不添加任何物質(zhì).121 ℃、20 min滅菌后接入培養(yǎng)180 h的種子液5 mL(為保證接種量的一致性,將1 mL槍頭頭部孔徑剪大,用1 mL自動移液器分5次吸取種子液分別添加到不同培養(yǎng)基中.處理中,每次取樣前將種子液搖勻,并顛倒取樣順序),培養(yǎng)溫度26 ℃,搖床轉(zhuǎn)速130 r/min,培養(yǎng)時間為300 h[7-8].

2.2.4 蟲草胞外多糖提取.

(1) 發(fā)酵樣品和透析袋的預處理.①發(fā)酵菌液離心(4 000 r/min×20 min),過濾,得到上清液和沉淀(菌絲體).②將透析袋剪成適當長度小段,在200 mL質(zhì)量濃度為20 g/L的碳酸氫鈉和濃度為1 mmol/L EDTA (pH=8.0)(體積比1∶1)中將透析袋煮沸10 min,用蒸餾水清洗透析袋,在濃度為1 mmol/L EDTA(pH=8.0)中將透析袋煮沸10 min,冷卻后存放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

(2) 醇沉.取濾液50 mL,加入4倍體積的體積分數(shù)為95%乙醇溶液,于4 ℃下靜置12 h,離心(3 000 r/min×15 min),過濾,取沉淀.加入少量無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌沉淀并置于-25 ℃冷凍干燥.35 ℃解析至恒質(zhì)量,即得冬蟲夏草胞外粗多糖.

(3) 脫蛋白.取冬蟲夏草胞外粗多糖,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL溶液.配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL胰蛋白酶溶液,保持酶解溫度為37 ℃,pH7.5.將胞外粗多糖與胰蛋白酶按12∶1混合,酶解45 min.酶解后100 ℃水浴滅酶5 min,冷卻至室溫.離心(3 500 r/min×5 min),取上清液,加入體積分數(shù)為20%TCA溶液.靜置12 h,離心取上清液,濃縮至相對密度為1.05(20～25 ℃),加入4倍體積的體積分數(shù)為95%乙醇,靜置12 h,離心得沉淀,加入適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,抽濾,干燥后得冬蟲夏草胞外多糖.

(4) 脫色.胞外多糖溶液加1.5%活性炭去色素,煮沸10～20 min,離心(4 000 r/min×20 min),過濾,留濾液.

(5) 透析.從冰箱中取出處理過的透析袋,用蒸餾水清洗,裝入脫色后的多糖溶液,置于蒸餾水中透析24 h,將透析后的溶液加3倍體積乙醇于4 ℃沉淀12 h,離心沉淀干燥,得冬蟲夏草胞外多糖.

2.2.5 蟲草胞內(nèi)多糖提取.

發(fā)酵所得的蟲草菌絲體用研缽研碎,準確稱取干燥的菌絲體50 g,按料液體積比1∶30加入蒸餾水.85 ℃水浴浸提3 h,濾渣反復浸提3次,合并濾液,離心(2 500 r/min×20 min)取上清液.50 ℃減壓濃縮至200 mL,加人4倍體積的體積分數(shù)為95%乙醇溶液,于4 ℃下靜置12 h,離心(3 000 r/min×15 min)得沉淀.加入少量無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌沉淀并置于-25 ℃冷凍干燥.35 ℃解析至恒質(zhì)量,即得冬蟲夏草胞內(nèi)粗多糖[9].

同胞外多糖的制備步驟(3)、步驟(4)一樣,得胞內(nèi)多糖.

2.3 樣品處理

2.3.1 觀察菌絲體長勢.菌絲體長勢是評價菌絲體生長情況的重要指標.以菌絲體長勢為指標,觀察并記錄每種配方中菌絲體的長勢.觀察結(jié)果用很強、強、較強、弱4個等級表示.

2.3.2 測定菌絲體的生物量干重.采用干質(zhì)量法,離心(4 000 r/min×10 min),取菌絲體用蒸餾水沖洗2次后于60 ℃烘干箱中烘12 h至質(zhì)量恒定,稱量記錄干菌質(zhì)量.如上步驟,進行3次,取平均值.

2.3.3 多糖用苯酚-硫酸法測定[10].

3 結(jié)果與分析

3.1 不同質(zhì)量濃度KI溶液對冬蟲夏草液體發(fā)酵液中蟲草生物量的影響

由表2可見,KI溶液對冬蟲夏草液體發(fā)酵液中蟲草生物量的作用明顯.配方一作為對照試驗沒有加入KI溶液,蟲草的生物量質(zhì)量濃度為5.58 mg/mL,隨著添加KI溶液質(zhì)量濃度的增大,蟲草生物量也在迅速增加,且菌絲體長勢逐漸增強,當添加KI溶液質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,蟲草生物量達到了峰值.隨后,當添加的KI溶液質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時,蟲草的生物量并沒有隨之增加,反而呈下降趨勢,菌絲體的長勢在逐漸減弱,KI溶液添加量質(zhì)量濃度為8 mg/mL時,蟲草生物量質(zhì)量濃度降為4.21 mg/mL,和配方一無KI溶液相比,不僅沒有促進,還起到了抑制的效果,不利于蟲草菌絲體的培養(yǎng).可見,KI溶液對于蟲草的長勢以及生物量有一個最適合的質(zhì)量濃度,過多或者過少都不利于冬蟲夏草生物量的積累,當KI質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,是最優(yōu)質(zhì)量濃度梯度,得到的蟲草生物量含量最高.

表2 不同質(zhì)量濃度KI溶液對蟲草生物量的影響Table2 Effects of KI solution of different concentration on biomass of Cordyceps sinensis

注: 菌絲體長勢 +表示弱,++表示較強,+++表示強,++++表示很強.*p<0.05,與配方一 相比,差異顯著;**p<0.01,與配方一相比,差異極顯著.

3.2 不同質(zhì)量濃度KI溶液對冬蟲夏草液體發(fā)酵液中蟲草多糖含量的影響

由表3可見,配方一作為對照試驗沒有加入KI溶液.當添加KI溶液質(zhì)量濃度為0～5 mg/mL 時,蟲草胞內(nèi)多糖含量平穩(wěn)增加;當KI溶液質(zhì)量濃度添加量為5 mg/mL時,胞內(nèi)多糖含量達26.4 mg/g,此時蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最高.隨著KI添加量的進一步增加,蟲草胞內(nèi)多糖含量在逐漸減少,配方九中KI溶液添加量為8 mg/mL,蟲草胞內(nèi)多糖含量為24.1 mg/g,和配方一相比雖然增加幅度也很大,但并不是最優(yōu)質(zhì)量濃度梯度.當KI溶液質(zhì)量濃度為0～5 mg/mL時,蟲草胞外多糖含量逐漸增加;配方六中KI溶液添加量為5 mg/mL時,蟲草胞外多糖產(chǎn)量最高質(zhì)量濃度達3.6 mg/mL.同樣隨著添加KI溶液質(zhì)量濃度的增加,蟲草胞外多糖含量明顯下降,配方九中KI溶液添加量為8 mg/mL,蟲草胞外多糖含量為2.1 mg/mL,較配方六明顯減少許多.由表3可得,不同質(zhì)量濃度KI溶液對胞內(nèi)多糖和胞外多糖含量的影響,KI質(zhì)量濃度為5 mg/mL都是最優(yōu)質(zhì)量濃度梯度,所得到的蟲草多糖含量最高.

表3 不同質(zhì)量濃度KI溶液對蟲草多糖含量的影響Table3 Effects of KI solution of different concentrations on content of cordyceps polysaccharide

注: *p<0.05,與配方一相比,差異顯著;**p<0.01,與配方一相比,差異極顯著.

4 討 論

本研究結(jié)果表明,不同質(zhì)量濃度梯度KI溶液的添加對冬蟲夏草液體發(fā)酵液中蟲草生物量和蟲草多糖的合成有不同程度的影響.從蟲草生物量方面看,當KI溶液質(zhì)量濃度在1～7 mg/mL時有促進作用,蟲草生物量均高于配方一(空白對照組);從蟲草多糖含量方面看,當KI溶液質(zhì)量濃度在1～8 mg/mL時有促進作用,蟲草多糖含量均高于配方一(空白對照組).其中當KI質(zhì)量濃度為0～5 mg/mL時,蟲草生物量隨著KI溶液濃度的增加在迅速增加,蟲草胞內(nèi)多糖含量與胞外多糖含量平穩(wěn)增加,說明KI溶液質(zhì)量濃度在0～5 mg/mL范圍內(nèi)時蟲草生物量和蟲草多糖含量均呈上升趨勢.當KI質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,蟲草生物量達31.64 mg/mL,且菌絲體長勢很強,胞內(nèi)多糖為26.4 mg/g,胞外多糖為3.6 mg/mL,對蟲草生物量的影響和蟲草多糖合成的促進作用最明顯,說明KI質(zhì)量濃度為5 mg/mL的抗氧化性對蟲草菌絲體的培養(yǎng)和蟲草多糖的合成產(chǎn)生顯著的影響,為最優(yōu)質(zhì)量濃度梯度.

從微生物代謝角度進行分析可知,菌絲體的液體發(fā)酵培養(yǎng)中,菌絲體極易接觸空氣進而被氧化.因此KI溶液的添加能直接與氧氣進行氧化還原反應,保護菌絲體,促進菌絲體生長,增加菌絲體生物量,保護糖類代謝轉(zhuǎn)化,促進多糖的合成.但當KI溶液濃度過高時,液體培養(yǎng)基會出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,并伴隨膠體產(chǎn)生,不利于蟲草菌絲體的培養(yǎng)和蟲草多糖的合成.關于KI溶液對蟲草素等其他成分的合成促進機理還不明確,有待進一步探討.

[1] 鄒贏鋅,陳雅琳,儲智勇,等.冬蟲夏草成分及活性研究進展[J].海軍醫(yī)學雜志,2014(1):83-85.

(Zou Yingxin,Chen Yalin,Chu Zhiyong,et al.Research Advance in Constituents and Pharmacological Activities of Cordyceps sinensis[J].Journal of Navy Medicine,2014(1):83-85.)

[2] 劉雪芹,于湄,張燕,等.蟲草多糖對2型糖尿病小鼠InsR/IRS-1通路及糖代謝的影響[J].中國藥師,2011,14(2):163-166.

(Liu Xueqin,Yu Mei,Zhang Yan,et al.Effects of Cordyceps Polysaccharide on InsR/IRS-1 Pathway and Glucose Metabolism in Type 2 Diabetic Mice[J].China Pharmacist,2011,14(2):163-166.)

[3] Hou Z,Zhang Z,Wu H.Effect ofSanguisdraxonis(a Chinese Traditional Herb) on the Formation of Insulin Resistance in Rats[J].Diabetes Research and Clinical Practice,2005,68(1):3-11.

[4] 張翼,王海燕,李軍延,等.不同劑量的碘化鉀與碘酸鉀對大鼠血漿抗氧化能力的影響[J].中國地方病防治雜志,2013(3):166-168.

(Zhang Yi,Wang Haiyan,Li Junyan,et al.Effect of Potassium Iodide and Potassium Iodate on Antioxidative Capability of Rat Blood Plasma[J].Chinese Journal of Control of Endemic Diseases,2013(3):166-168.)

[5] 吳玲芳,王曉瑞,柳志強,等.冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)的研究進展[J].發(fā)酵科技通訊,2014,43(4):25-29.

(Wu Lingfang,Wang Xiaorui,Liu Zhiqiang,et al.Research Advances in Submerged Fermentation ofCordycepssinensis[J].Fermentation Technology Communication,2014,43(4):25-29.)

[6] 李春麗,劉曉蘭,陳慧鑫,等.蛹蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)菌絲體及胞外多糖的初步研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工:創(chuàng)新版,2010(2):22-26.

(Li Chunli,Liu Xiaolan,Chen Huixin,et al.Elementary Study on the Submerged Culture Conditions for Micellium and Exopolyasccharides Production byCordycepsmilitaris[J].Farm Products Processing: Innovational Edition,2010(2):22-26.)

[7] 王戰(zhàn)勇,張建東,李瑩,等.北蟲草液體培養(yǎng)基的研究[J].遼寧石油化工大學學報,2004,24(1):19-21,25.

(Wang Zhanyong,Zhang Jiandong,Li Ying,et al.Liquid Medium onCordycepsmilitaris[J].Journal of Liaoning University of Petroleum & Chemical Technology,2004,24(1):19-21,25.)

[8] 張秀君.微生物在溫室氣體排放與吸收中的多樣性[J].沈陽大學學報,2008,20(4):1-5.

(Zhang Xiujun.Microorganism Diversity in Production and Emission of Greenhouse Gases[J].Journal of Shenyang University,2008,20(4):1-5.)

[9] 周國海,張泳,趙力超,等.蛹蟲草多糖提取純化工藝研究[J].食品與機械,2014(5):220-224.(Zhou Guohai,Zhang Yong,Zhao Lichao,et al.Extraction and Purification of Polysaccharides fromCordycepsmilitaris[J].Food & Machinery,2014(5):220-224.)

[10] 來永斌,王琦,孫月.蛹蟲草多糖含量的測定與分析[J].中成藥,2001,23(7):517-518.

(Lai Yongbin,Wang Qi,Sun Yue.Determination and Analysis ofCordycepsmilitaris(Fr) Link’s Amylose Content[J].Chinese Traditional Patent Medicine,2001,23(7):517-518.)

【責任編輯: 祝 穎】

Effect of KI Solution on Contents of Polysaccharide and Biomass inCordycepssinensis

YangShaobin,ZhaoYing,SunHuizhen,ChenYubo

(College of Life Science and Bioengineering,Shenyang University,Shenyang 110044,China)

To study the effect KI of different concentration on the contents of polysaccharide and biomass inCordycepssinensisliquid fermentation medium,and select the optimal KI concentration to improve the polysaccharide contents and biomass inCordycepssinensis,KI of different concentration were added to theCordycepssinensisliquid fermentation medium,the biomass was measured and the cordyceps polysaccharides was extracted fromCordycepssinensis.The content was tested by using the phenol-sulfuric acid method.The results show that,in theCordycepssinensisfermentation medium,adding KI solution can obviously increase the contents of polysaccharide and biomass inCordycepssinensis.When the mass cencentration of KI is 5 mg/mL,biomass cencentration ofCordycepssinensisis 31.64 mg/100 mL,the mycelium growth is very strong,the content of intracellular polysaccharides is 26.4 mg/g,the concentration of extracellular polysaccharides is 3.6 mg/mL,which is the optimal concentration gradient.In the process ofCordycepssinensisliquid fermentation,adding KI solution can obviously increase the contents of polysaccharide and biomass.

Cordycepssinensis; KI; fermentation medium; biomass; cordyceps polysaccharide

2015-01-21

沈陽市科技計劃項目(F13-216-9-00).

楊紹斌(1959-),男,遼寧沈陽人,沈陽大學教授.

2095-5456(2015)04-0272-05

TS 201.3

A