蔡 軼 趙 莉

(廣州醫(yī)科大學藥學院蛇毒研究所，廣東廣州511436)

AMPK信號通路在ECG誘導人鼻咽癌細胞株C666-1凋亡中的作用研究

蔡 軼 趙 莉

(廣州醫(yī)科大學藥學院蛇毒研究所，廣東廣州511436)

目的研究AMPK信號通路在ECG誘導人鼻咽癌細胞株C666-1凋亡中的作用。方法人鼻咽癌C666-1細胞給予AMPK特異性抑制劑compound C或不同濃度ECG處理后，分別采用CCK-8法和TUNEL染色法檢測細胞增殖情況和凋亡;采用Western blotting法檢測AMPK、p70S6K、S6等相關(guān)蛋白磷酸化水平。結(jié)果ECG可劑量依賴性地增加C666-1細胞中AMPK的磷酸化水平并抑制p70S6K和S6的磷酸化;給予compound C預處理之后可顯著逆轉(zhuǎn)ECG對C666-1細胞增殖和凋亡的影響，并逆轉(zhuǎn)ECG對AMPK、p70S6K和S6等磷酸化水平的影響。結(jié)論ECG通過調(diào)控AMPK依賴的通路抑制人鼻咽癌細胞株C666-1增殖，并誘導其凋亡。

表兒茶素沒食子酸酯;AMP激活的蛋白激酶;C666-1

表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)是綠茶多酚中的主要成分之一。研究表明ECG具有廣泛的生物學功能，主要集中在消除自由基、抗氧化、殺菌抗病毒和抗腫瘤作用等方面［1－3］。我們在前期的研究工作中首次發(fā)現(xiàn)ECG可時間和劑量依賴性地抑制人鼻咽癌C666-1細胞增殖，并誘導其凋亡(已另文發(fā)表)。然而，ECG調(diào)控C666-1細胞增殖與凋亡的具體分子機制并不十分清楚。

AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種在真核細胞中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通常以異源三聚體的形式存在于哺乳動物幾乎所有組織中［4］。激活AMPK可以增強分解代謝，抑制合成代謝，并調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和自噬等多種生物學過程［5］。近年來AMPK在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的關(guān)系逐漸受到重視。AMPK可通過調(diào)控下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路調(diào)節(jié)肝癌、肺癌、鼻咽癌等多種腫瘤細胞的增殖與凋亡。然而，目前ECG與AMPK之間的關(guān)系國內(nèi)外研究較少，AMPK是否參與ECG對人鼻咽癌細胞C666-1的增殖與凋亡的調(diào)控作用尚未見任何報道。本實驗以人鼻咽癌細胞株C666-1為研究對象，通過觀察ECG對AMPK信號通路的調(diào)控作用以及干預AMPK之后ECG對C666-1細胞增殖和凋亡的影響，初步探討ECG抑制鼻咽癌的具體分子機制，為將ECG發(fā)展成治療鼻咽癌的新型抗腫瘤藥物提供必要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑鼻咽癌細胞株C666-1由南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院腫瘤研究所姚開泰院士惠贈。DMEM高糖培養(yǎng)基和新生牛血清購自Gibco公司。ECG(純度＞95%)購自Sigma-Aldrich公司，用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成100 mM，－20℃避光保存;Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁化學研究所;一步法TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司;p-AMPK，AMPK、pp70S6K、p70S6K、p-S6和S6兔多抗購自基因有限公司(CST);β-actin小鼠單抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠、羊抗兔二抗購自廣州市潔利生物醫(yī)學有限公司(Santa Cruz);AMPK抑制劑compound C購自Sigma-Aldrich公司，用DMSO配成50 mM，－20℃避光保存。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理鼻咽癌細胞株C666-1使用含10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)期生長細胞，根據(jù)實驗要求接種至不同規(guī)格的細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后進行血清饑餓12 h，隨后無血清條件下加入指定濃度的ECG或AMPK抑制劑compound C(20 μM)培養(yǎng)預定時間，培養(yǎng)結(jié)束后進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖接種C666-1細胞于96孔板，血清饑餓完成之后，加入20 μM compound C預處理1 h后，再加入ECG繼續(xù)處理48 h，每組設(shè)6個平行孔。處理結(jié)束后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，450 nm波長處檢測吸光度值A(chǔ)，并計算細胞增殖。增殖率(%)=實驗組OD450/對照組OD450×100%。

1.4 TUNEL染色法檢測細胞凋亡檢測步驟按原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。藥物作用結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗，風干后室溫下置于4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗，1%Triton X-100通透液通透細胞5 min，3%H2O2封閉液封閉15 min，加入DNase I反應(yīng)液避光反應(yīng)30 min，漂洗DNase I反應(yīng)液，加入TdT酶反應(yīng)液，37℃避光反應(yīng)30 min，漂洗后，于熒光顯微鏡下激發(fā)波長450～500 nm，發(fā)射波長515～565 nm檢測熒光。細胞核呈綠色為TUNEL反應(yīng)陽性細胞。顯微鏡下隨機計數(shù)10個高倍視野下陽性細胞所占百分數(shù)即為細胞凋亡率。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達按照實驗要求加入ECG或AMPK抑制劑compound C處理細胞，給藥結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，加入2×SDS sample buffer提取細胞總蛋白，依次進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)、封閉，4℃孵育一抗過夜，第二日室溫孵育二抗1 h，采用化學發(fā)光法檢測蛋白表達情況，使用Image J軟件進行條帶灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學方法使用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行多組間比較，P≤0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ECG對人鼻咽癌C666-1細胞AMPK信號通路的影響不同濃度ECG(0、25、50、100 μM)處理C666-1細胞48 h后，采用Western Blotting檢測C666-1細胞AMPK、p70S6K、S6三種蛋白磷酸化水平的變化。結(jié)果表明，隨ECG濃度的增加，AMPK的磷酸化水平顯著增加，其下游mTOR信號通路中p70S6K和S6的磷酸化水平均顯著下降(圖1)。

圖1 ECG對人鼻咽癌C666-1細胞AMPK信號通路的影響

2.2 ECG通過激活AMPK抑制人鼻咽癌C666-1細胞增殖為了明確AMPK是否參與了ECG對C666-1增殖的影響，我們給予C666-1細胞20 μM compound C預處理1 h，再加入ECG(100 μM)繼續(xù)刺激C666-1細胞48 h，采用CCK-8檢測試劑盒檢測ECG對細胞增殖的影響。結(jié)果表明，單獨給予ECG，C666-1細胞的增殖率顯著下降，給予compound C預處理可顯著改善ECG誘導的細胞增殖率下降(圖2)。

2.3 ECG通過激活AMPK誘導人鼻咽癌C666-1細胞凋亡為了明確AMPK是否參與了ECG對C666-1凋亡的影響，我們給予C666-1細胞20 μM compound C預處理1 h，再加入ECG(100 μM)繼續(xù)刺激C666-1細胞48 h，采用Tunel法檢測ECG對細胞凋亡的影響。結(jié)果表明，單獨給予ECG，C666-1細胞的凋亡率顯著增加，給予compound C預處理可保護ECG誘導的細胞凋亡(圖3)。

圖2 ECG通過激活AMPK抑制人鼻咽癌C666-1細胞增殖與對照組比較，*P＜0.05

圖3 ECG通過激活AMPK誘導人鼻咽癌C666-1細胞凋亡與對照組比較*P＜0.05

2.4 AMPK參與ECG對其下游信號通路的調(diào)控作用C666-1細胞給予20 μM compound C預處理1 h，再加入ECG(100 μM)繼續(xù)刺激C666-1細胞48 h，采用Western Blotting檢測C666-1細胞AMPK、p70S6K、S6三種蛋白磷酸化水平的變化。結(jié)果表明，給予compound C預處理可逆轉(zhuǎn)ECG對AMPK及其下游信號通路的調(diào)控作用(圖4)。

3 討論

鼻咽癌是我國南方地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一。由于鼻咽癌原發(fā)部位隱蔽，早期癥狀不明顯，因此大多數(shù)鼻咽癌患者發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期。單一采用放療手段治療中晚期鼻咽癌患者，其5～10年生存率僅為40%左右［6］。因此，尋找有效低毒的藥物與放療聯(lián)合應(yīng)用來提高鼻咽癌的治療效果是目前需要解決的難題。ECG主要存在于茶屬植物中，是綠茶多酚的主要成分之一。大量研究證明ECG具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤細胞的侵襲等多種生物學作用［7］。在本實驗室前期的研究工作中首次發(fā)現(xiàn)ECG可抑制人鼻咽癌細胞C666-1的增殖并誘導其凋亡，提示ECG可能是一個潛在的治療鼻咽癌的藥物。但是迄今為止，ECG調(diào)控C666－1細胞的具體分子機制并不十分清楚，值得進一步研究。

圖4 AMPK參與ECG對其下游信號通路的調(diào)控作用

AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子。近年來，AMPK在腫瘤中的作用日益受到人們的關(guān)注。研究表明AMPK可降低腫瘤細胞在糖饑餓等代謝應(yīng)激狀態(tài)下的代謝活動，進而增強細胞的存活能力。糖饑餓時，AMPK被激活并進一步通過結(jié)節(jié)性硬化復合體(tuberous sclerosis complex，TSC)突變基因抑制其下游底物哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)減少蛋白合成、抑制腫瘤細胞生長［8］。mTOR與其結(jié)合蛋白可形成兩種復合體，即mTORC1和mTORC2。mTORC1對雷帕霉素敏感，可調(diào)節(jié)mTOR下游底物核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)及真核翻譯啟動因子(4EBP1);而mTORC2則調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架及蛋白激酶(Akt)［9］。在本實驗中，我們首次發(fā)現(xiàn)ECG可劑量依賴性地增加C666-1細胞中AMPK的磷酸化水平進而抑制mTOR下游p70S6K和S6的磷酸化。為了進一步明確AMPK依賴的信號通路是否參與了ECG對人鼻咽癌C666-1細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，我們給予C666-1細胞AMPK的特異性抑制劑compound C預處理，并分別檢測細胞的增殖的凋亡。單獨給予ECG之后，C666-1細胞增殖率下降，凋亡率增加。給予compound C預處理可顯著逆轉(zhuǎn)ECG對C666-1增殖和凋亡的影響。進一步的研究表明compound C預處理還可逆轉(zhuǎn)ECG對AMPK及其下游信號通路的調(diào)控作用。

綜上所述，本實驗證明ECG通過調(diào)控AMPK及其下游mTOR信號通路誘導人鼻咽癌C666-1細胞凋亡。本研究為ECG在鼻咽癌防治中的應(yīng)用提供了必要的理論依據(jù)。

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ECG-induced cell apoptosis through AMPK signaling pathways in human nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1

CAI Yi ZHAO Li
(Guangzhou Venom Research Institute，Guangzhou 511436，China)

Objective:To study whether AMPK participate in the effect of ECG on the apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1.Methods:C666-1 cells were treated with different concentrations(0～100 μM)ECG or compound C，CCK-8 assay was used to evaluate the proliferation and Tunel assay was used to investigate the apoptosis of C666-1 cells.Western blotting was performed to detect the expression levels of p-AMPK，p-p70S6K and p-S6.Results:ECG increased the protein expression of p-AMPK and inhibited the expression level of p-p70S6K and p-S6 in C666-1 cells.Pretreated with compound C abrogated the effect of ECG on the proliferation，apoptosis and the protein expression of p-AMPK，p-p70S6K and p-S6 in nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1.Conclusion:ECG inhibits proliferation and induces apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1 by regulating AMPK-dependent signaling pathway.

epicatechin gallate;AMP-activated protein kinase;C666-1

R967

A

1004-7115(2015)07-0721-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.07.001

2015-01-18)

國家自然科學基金青年項目(81300085)，廣東省自然科學基金博士啟動項目(S2013040013895)，廣東省科技計劃項目-廣東省

高科技發(fā)展專項資金項目(2013B010403024)，廣州市教育局市屬高?？萍加媱濏椖?1201430926)，廣州醫(yī)科大學博士啟動項目

(2012C03)。

蔡軼(1984－)，男，安徽合肥人，助理研究員，博士，研究方向:藥理學。

趙莉。