伍啟康，吳奎海，崔東嵐

(佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 佛山528000)

嗜麥芽窄食單胞菌是一種廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境的條件致病菌，隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用，以及侵入性治療技術(shù)的不斷應(yīng)用，該菌已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一，在非發(fā)酵菌的分離率中僅次于鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌[1]，復(fù)方新諾明是臨床抗嗜麥芽窄食單胞菌感染的首選用藥，但近幾年，臨床經(jīng)常能分離到耐復(fù)方新諾明的嗜麥芽窄食單胞菌，其耐藥性常和I類整合子中的sul1基因[2]以及ISCR2攜帶的sul2相關(guān)[3]。本文主要對(duì)耐復(fù)方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌株相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行基因分型。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 我院2013年1月至2013年12月共分離獲得126株嗜麥芽窄食單胞菌，其中對(duì)復(fù)方新諾明耐藥的有22株，剔除同一患者相同部位7d內(nèi)的重復(fù)分離株。

1.2 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK2-compact儀器及其配套GN鑒定卡進(jìn)行菌種鑒定，藥敏試驗(yàn)采用K-B法。依據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)2013年標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌A TCC27853。

1.3 主要儀器和試劑 德國(guó)Eppendorf公司的PCR擴(kuò)增儀器，Bio-Rad公司的凝膠儀,TaqDNA聚合酶﹑dNTPs、DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品。復(fù)方新諾明藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，

1.4 PCR擴(kuò)增 DNA的提取參考試劑盒說(shuō)明書，-40℃保存。相關(guān)基因的PCR反應(yīng)體系均為20μl體積,其中含 Mg2+的 10×buffer 2μl，dNTP 200μmol/L，上下游引物 0.2μmol/L，DNA 模板 1μl，TaqDNA 聚合酶1U，加入滅菌去離子水至20μl。所擴(kuò)增的sul1、sul2、ISCR1、ISCR2 陽(yáng)性菌株均為本實(shí)驗(yàn) PCR擴(kuò)增陽(yáng)性并測(cè)序驗(yàn)證，具體的引物序列和退火溫度見表1。

表1 PCR反應(yīng)的引物序列

圖1 部分耐復(fù)方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌ERIC-PCR電泳結(jié)果

1.5 PCR產(chǎn)物序列分析 sul1和整合子I陽(yáng)性產(chǎn)物送華大基因科技公司進(jìn)行純化并雙向測(cè)序，利用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列校正，在Gen-Bank中用Blastn進(jìn)行核酸同源性搜索，分析基因類型。

1.6 ERIC-PCR 對(duì)耐復(fù)方新諾明的嗜麥芽窄食單胞菌進(jìn)行基因分型，分析其遺傳相關(guān)性。引物ERIC-2:AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG[6]。反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性 5min；94℃變性 1 min，26℃退火 2min，72℃延 伸 1min，4 個(gè) 循 環(huán) ；94℃變 性 1 min，40℃退火 1min，72℃延伸 1min，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10min。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn) 復(fù)方新諾明的耐藥率為17.4%(22/126)，中介為4.0%(5/126)，敏感率為 78.6%(99/126)。

2.2 PCR擴(kuò)增 在126株嗜麥芽窄食單胞菌中，sul2和ISCR2均陰性。在22株耐復(fù)方新諾明菌株中，15株I類整合子基因盒和sul1均為陽(yáng)性，有1株僅sul1陽(yáng)性。在104株復(fù)方新諾明中介或敏感菌株中，sul1和I類整合子基因盒檢測(cè)均為陰性。

2.3 I類整合子基因盒 15株I類整合子基因盒測(cè)序結(jié)果：dfrA17,aadA5同時(shí)陽(yáng)性9株，aacA4、blaIMP-25、blaOXA-30、catB3 同 時(shí) 陽(yáng) 性 1 株 ，aadB、aadA2同時(shí)陽(yáng)性 1株，dfrA15陽(yáng)性 4株，qacF陽(yáng)性1株。

2.4 ERIC-PCR 電泳條帶集中分布在250～3000bp之間，分21個(gè)基因型，部分結(jié)果見圖1。

3 討論

整合子因其在細(xì)菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的重要作用而受到研究者的關(guān)注，I類整合子在臨床上最常見，結(jié)構(gòu)由3個(gè)部分組成:5’保守末端(5’conserved segment,5’CS)、 3’ 保守末端(3’conserved segment,3’CS)和兩者之間的可變區(qū)(variable region)。3’CS包括3個(gè)開放讀碼框(ORF)：磺胺耐藥基因 (sul1)，季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因 (qacE△1)及功能不明的ORF5[7]?？勺儏^(qū)帶有不同數(shù)量的基因盒，大部分是編碼各種抗生素抗性的耐藥基因盒。本研究結(jié)果表明，耐復(fù)方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌I類整合子攜帶率較高，達(dá)到68%(15/22)。從基因盒攜帶的耐藥基因來(lái)看，包括耐甲氧芐啶類 (dfrA17，dfrA15)、耐氨基糖苷類(aadA5，aacA4，aadB ，aadA2)、耐氯霉素(catB3)、β-類酰胺酶類(blaIMP-25，blaOXA-30)、耐消毒劑(qacF)。 Huang 等[8]通過(guò)基因敲除的方法，發(fā)現(xiàn)I類整合子能明顯增加復(fù)方新諾明的耐藥性，但消毒劑的MIC濃度未見明顯改變，可能是qacF基因產(chǎn)生的耐藥作用較小，主要與菌體外膜通透性有關(guān)。嗜麥芽窄食單胞菌I類整合子攜帶的氨基糖苷類耐藥基因可以增加氨基糖類的MIC濃度，但其染色體攜帶的Aph(3’)-IIc、aac(6′)-Ib′、SmeZ 、SmeJK 可導(dǎo)致高水平氨基糖類耐藥[9,10]。ISCR2屬于插入序列一種，通過(guò)滾換復(fù)制轉(zhuǎn)移鄰近序列，是一個(gè)強(qiáng)有力的移動(dòng)系統(tǒng)，攜帶多重耐藥編碼基因[11,12]，如SXT、質(zhì)粒介導(dǎo)的氯霉素和磺胺類藥物耐藥，常與sul2基因相關(guān)。在126菌株中未檢出基因ISCR2、sul2，可能是由于地區(qū)和菌種差異，sul2在歐洲、南美地區(qū)或腸桿菌科細(xì)菌的檢出率相對(duì)較高[3]。在6株耐復(fù)方新諾明菌株中，4種耐藥基因均未檢出，可能存在其他耐藥機(jī)制，如外排泵、生物膜作用[13-15]。

ERIC-PCR是以腸桿菌科基因間重復(fù)序列為引物進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增出多態(tài)性的DNA圖譜。它快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、重復(fù)性較好，其分辨率與脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)高度一致[16]。本研究中的22株耐復(fù)方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌分型較廣，不存在院內(nèi)暴發(fā)流行。

[1]郝會(huì)青,胡利民.嗜麥芽窄食單胞菌醫(yī)院感染分布及耐藥性分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(4):414-417.

[2]Hu LF,Chang X,Ye Y,et al.Stenotrophomonas maltophilia resistance to trimethoprim/sulfamethoxazole mediated by acquisition of sul and dfrA genes in a plasmid-mediated class 1 integron[J].Int J Antimicrob Agents,2011,37(3):230-234.

[3]Toleman MA,Bennett PM,Bennett DM,et al.Global emergence of trimethoprim/sulfamethoxazole resistance in Stenotrophomonas maltophilia mediated by acquisition of sul genes[J].Emerg Infect Dis,2007,13(4):559-565.

[4]Byrne-Bailey KG,Gaze WH,Kay P,et al.Prevalence of sulfonamide resistance genes in bacterial isolates from manured agricultural soils and pig slurry in the United Kingdom[J].Antimicrob A-gents Chemother,2005,53(2):696-702.

[5]Levesque C,Piche L,Larose C,et al.PCR mapping of integrons reveals several novel combinations of resistance genes[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1995,39(1):185-191.

[6]Munoz MA,Welcome FL,Schukken YH,et al.Molecular epidemiology of two Klebsiella pneumoniae mastitis outbreaks on a dairy farm in New York State[J].J Clin Microbiol,2007,45(12):3964-3971.[7]Domingues S,da Silva GJ,Nielsen KM.Integrons:Vehicles and pathways for horizontal dissemination in bacteria[J].Mob Genet Elements,2012,2(5):211-223.

[8]Huang YW,Hu RM,Lin YT,et al.The Contribution of Class 1 Integron to Antimicrobial Resistance in Stenotrophomonas maltophilia[J].Microb Drug Resist,2014,22.

[9]Gould VC,Okazaki A,Avison MB.Coordinate hyperproduction of SmeZ and SmeJK efflux pumpsextendsdrugresistance in Stenotrophomonas maltophilia[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(1):655-657.

[10]Okazaki A,Avison MB.Aph(3')-IIc,an aminoglycoside resistance determinant from Stenotrophomonas maltophilia[J].Antimicrob A-gents Chemother,2007,51(1):359-360.

[11]Toleman MA,Bennett PM,Walsh TR.ISCR elements:Novel gene-capturing systems of the 21st century[J].Microbiology and Molecular Biology,Reviews,2006,70(2):296-316.

[12]Vilacoba E,Almuzara M,Gulone L,et al.Emergence and spread of plasmid-borne tet(B):ISCR2 in minocycline-resistant Acinetobacter baumannii isolates.Antimicrob Agents Chemother,2013,57(1):651-654.

[13]Liaw SJ,Lee YL,Hsueh PR.Multidrug resistance in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia:roles of integrons,efflux pumps,phosphoglucomutase (SpgM),and melanin and biofilm formation[J].Int J Antimicrob Agents.2010,35(2):126-130.

[14]Gould VC,Avison MB.SmeDEF-mediated antimicrobial drug resistance in Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates having defined phylogenetic relationships[J].J Antimicrob Chemother,2006,57(6):1070-1076.

[15]Zhang L,Li XZ,Poole K.SmeDEF multidrug efflux pump contributes to intrinsic multidrug resistance in Stenotrophomonas maltophilia[J].Antimicrob Agents Chemother.2001,45(12):3497-3503.

[16]Juhász E,Krizsán G,Lengyel G,et al.Infection and colonization by Stenotrophomonas maltophilia:antimicrobial susceptibility and clinical background of strains isolated at a tertiary care centre in Hungary[J].Ann Clin Microbiol Antimicrob,2014,13(1):333.