伍啟康，吳奎海，崔東嵐

(佛山市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東 佛山528000)

嗜麥芽窄食單胞菌是一種廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境的條件致病菌，隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用，以及侵入性治療技術(shù)的不斷應(yīng)用，該菌已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一，在非發(fā)酵菌的分離率中僅次于鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌[1]，復(fù)方新諾明是臨床抗嗜麥芽窄食單胞菌感染的首選用藥，但近幾年，臨床經(jīng)常能分離到耐復(fù)方新諾明的嗜麥芽窄食單胞菌，其耐藥性常和I類整合子中的sul1基因[2]以及ISCR2攜帶的sul2相關(guān)[3]。本文主要對耐復(fù)方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌株相關(guān)基因進(jìn)行檢測，并對其進(jìn)行基因分型。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 我院2013年1月至2013年12月共分離獲得126株嗜麥芽窄食單胞菌，其中對復(fù)方新諾明耐藥的有22株，剔除同一患者相同部位7d內(nèi)的重復(fù)分離株。

1.2 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗 法國生物梅里埃公司的VITEK2-compact儀器及其配套GN鑒定卡進(jìn)行菌種鑒定，藥敏試驗采用K-B法。依據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)2013年標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌A TCC27853。

1.3 主要儀器和試劑 德國Eppendorf公司的PCR擴(kuò)增儀器，Bio-Rad公司的凝膠儀,TaqDNA聚合酶﹑dNTPs、DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品。復(fù)方新諾明藥敏紙片購自英國OXOID公司，

1.4 PCR擴(kuò)增 DNA的提取參考試劑盒說明書，-40℃保存。相關(guān)基因的PCR反應(yīng)體系均為20μl體積,其中含 Mg2+的 10×buffer 2μl，dNTP 200μmol/L，上下游引物 0.2μmol/L，DNA 模板 1μl，TaqDNA 聚合酶1U，加入滅菌去離子水至20μl。所擴(kuò)增的sul1、sul2、ISCR1、ISCR2 陽性菌株均為本實驗 PCR擴(kuò)增陽性并測序驗證，具體的引物序列和退火溫度見表1。

表1 PCR反應(yīng)的引物序列

圖1 部分耐復(fù)方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌ERIC-PCR電泳結(jié)果

1.5 PCR產(chǎn)物序列分析 sul1和整合子I陽性產(chǎn)物送華大基因科技公司進(jìn)行純化并雙向測序，利用DNAstar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列校正，在Gen-Bank中用Blastn進(jìn)行核酸同源性搜索，分析基因類型。

1.6 ERIC-PCR 對耐復(fù)方新諾明的嗜麥芽窄食單胞菌進(jìn)行基因分型，分析其遺傳相關(guān)性。引物ERIC-2:AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG[6]。反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性 5min；94℃變性 1 min，26℃退火 2min，72℃延 伸 1min，4 個 循 環(huán) ；94℃變 性 1 min，40℃退火 1min，72℃延伸 1min，40 個循環(huán)；72℃延伸 10min。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗 復(fù)方新諾明的耐藥率為17.4%(22/126)，中介為4.0%(5/126)，敏感率為 78.6%(99/126)。

2.2 PCR擴(kuò)增 在126株嗜麥芽窄食單胞菌中，sul2和ISCR2均陰性。在22株耐復(fù)方新諾明菌株中，15株I類整合子基因盒和sul1均為陽性，有1株僅sul1陽性。在104株復(fù)方新諾明中介或敏感菌株中，sul1和I類整合子基因盒檢測均為陰性。

2.3 I類整合子基因盒 15株I類整合子基因盒測序結(jié)果：dfrA17,aadA5同時陽性9株，aacA4、blaIMP-25、blaOXA-30、catB3 同 時 陽 性 1 株 ，aadB、aadA2同時陽性 1株，dfrA15陽性 4株，qacF陽性1株。

2.4 ERIC-PCR 電泳條帶集中分布在250～3000bp之間，分21個基因型，部分結(jié)果見圖1。

3 討論

整合子因其在細(xì)菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的重要作用而受到研究者的關(guān)注，I類整合子在臨床上最常見，結(jié)構(gòu)由3個部分組成:5’保守末端(5’conserved segment,5’CS)、 3’ 保守末端(3’conserved segment,3’CS)和兩者之間的可變區(qū)(variable region)。3’CS包括3個開放讀碼框(ORF)：磺胺耐藥基因 (sul1)，季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因 (qacE△1)及功能不明的ORF5[7]。可變區(qū)帶有不同數(shù)量的基因盒，大部分是編碼各種抗生素抗性的耐藥基因盒。本研究結(jié)果表明，耐復(fù)方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌I類整合子攜帶率較高，達(dá)到68%(15/22)。從基因盒攜帶的耐藥基因來看，包括耐甲氧芐啶類 (dfrA17，dfrA15)、耐氨基糖苷類(aadA5，aacA4，aadB ，aadA2)、耐氯霉素(catB3)、β-類酰胺酶類(blaIMP-25，blaOXA-30)、耐消毒劑(qacF)。 Huang 等[8]通過基因敲除的方法，發(fā)現(xiàn)I類整合子能明顯增加復(fù)方新諾明的耐藥性，但消毒劑的MIC濃度未見明顯改變，可能是qacF基因產(chǎn)生的耐藥作用較小，主要與菌體外膜通透性有關(guān)。嗜麥芽窄食單胞菌I類整合子攜帶的氨基糖苷類耐藥基因可以增加氨基糖類的MIC濃度，但其染色體攜帶的Aph(3’)-IIc、aac(6′)-Ib′、SmeZ 、SmeJK 可導(dǎo)致高水平氨基糖類耐藥[9,10]。ISCR2屬于插入序列一種，通過滾換復(fù)制轉(zhuǎn)移鄰近序列，是一個強(qiáng)有力的移動系統(tǒng)，攜帶多重耐藥編碼基因[11,12]，如SXT、質(zhì)粒介導(dǎo)的氯霉素和磺胺類藥物耐藥，常與sul2基因相關(guān)。在126菌株中未檢出基因ISCR2、sul2，可能是由于地區(qū)和菌種差異，sul2在歐洲、南美地區(qū)或腸桿菌科細(xì)菌的檢出率相對較高[3]。在6株耐復(fù)方新諾明菌株中，4種耐藥基因均未檢出，可能存在其他耐藥機(jī)制，如外排泵、生物膜作用[13-15]。

ERIC-PCR是以腸桿菌科基因間重復(fù)序列為引物進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增出多態(tài)性的DNA圖譜。它快速、經(jīng)濟(jì)、簡便、重復(fù)性較好，其分辨率與脈沖場凝膠電泳(PFGE)高度一致[16]。本研究中的22株耐復(fù)方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌分型較廣，不存在院內(nèi)暴發(fā)流行。

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