尚麗紅,游瑞君,武小桐,王振興,張文艷

(山西省第二人民醫(yī)院腎移植中心，山西 太原030012)

多瘤病毒屬于乳多空病毒屬，其中BK病毒(BKV)和JC病毒(JCV)可以使人類致病。在腎移植病人，免疫功能低下[1-3]，多瘤病毒的潛伏感染率較高。約有10%~60%的腎移植患者可再次激活多瘤病毒，但不影響腎功能；1%~10%的腎移植患者可發(fā)生多瘤病毒相關(guān)性腎病(Polyomavirus-associated nephropathy,PVAN)[4]。

BKV是導(dǎo)致PVAN的主要原因[5]，與JCV具有75%的序列同源性[6]。據(jù)報(bào)道[6]，大約3%的JCV感染患者可導(dǎo)致PVAN的發(fā)生；但如果JCV與BKV同時發(fā)生感染的患者，PVAN發(fā)生的機(jī)率將上升到15%[7]。目前，尚無有效的抗病毒藥物。普遍的處理方法是恰當(dāng)?shù)卣{(diào)整免疫抑制劑的類型和用量以減少病毒的復(fù)制，但又增加引發(fā)排斥反應(yīng)的風(fēng)險。因此，建立快速、有效的檢測方法，對PVAN的早期預(yù)測和診斷對腎移植患者預(yù)后有著重要的臨床意義。

目前，常用的檢測方法[8,9]有：(1)尿液誘耳細(xì)胞(decoy細(xì)胞)細(xì)胞學(xué)檢測；(2)尿液、血液中PCR檢測DNA；(3)免疫組化檢查。近年來，人們推崇無創(chuàng)性檢測方法，即采用PCR檢測體液病毒DNA作為篩選。利用PCR方法檢測這兩種病毒具有更高的靈敏度和特異性，對監(jiān)測腎移植術(shù)后患者多瘤病毒的感染、及早發(fā)現(xiàn)和治療都具有指導(dǎo)作用。

因此，本文利用熒光定量PCR(探針法)方法，檢測腎移植術(shù)后患者體內(nèi)的BKV和JCV含量，為患者的臨床診斷和治療方案提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 分別收集山西省第二人民醫(yī)院腎移植中心2013年6月至2014年5月期間腎移植術(shù)后患者尿液標(biāo)本153例、血液標(biāo)本155例，其中男性92例，女性61例。所有患者自愿接受BKV、JCV病毒的檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本和試劑 在患者行腎移植術(shù)后，收集尿液和血液。具體收集方法如下：(1)血漿樣本采集：用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血3～5ml，注入含有EDTA的無菌收集管，立即輕輕顛倒混勻，室溫放置不超過4h，待樣本自行析出血漿或直接室溫1600rpm離心5min分離出血漿，轉(zhuǎn)移到1.5ml滅菌離心管中備用。(2)尿液樣本采集：留取中段晨尿10～20ml(不超過容器體積的2/3)密封送檢。(3)樣本保存：樣本應(yīng)盡快檢測，4℃保存不超過24h，-20℃條件下可以保存數(shù)月，-70℃條件下可以長期保存，但不可反復(fù)凍融。BK/JC病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自于北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板提取 (1)血漿或血清①在1.5ml離心管中加入100μl待測樣本，然后加入50μl濃縮液，振蕩15s混勻；②將上述離心管放入臺式離心機(jī)，13000r/min離心10min后取出；③小心吸出150μl上清液(盡量吸干上清液，但不要觸及沉淀)并棄去，保留沉淀；④向離心管中分別加入25μl裂解液，然后用吸頭對準(zhǔn)沉淀所在位置，將其挑離管底，并吹洗5次(關(guān)鍵步驟)；⑤振蕩15s將沉淀充分打散；⑥100℃條件下溫育10min；⑦13000r/min離心10min后將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，該上清液即純化的DNA溶液。(2)尿液將尿液送檢管振蕩15s，徹底混勻(關(guān)鍵步驟)；取其中 1ml至 1.5ml離心管中，13000r/min離心10min后棄去上清；加入50μl裂解液，然后用吸頭對準(zhǔn)沉淀所在位置，將其挑離管底，并吹洗5次(關(guān)鍵步驟)；之后參照上述血漿或血清樣本操作5～7步驟。

1.3.2 定量PCR檢測腎移植患者術(shù)后BKV和JCV感染 (1)試劑配制：確定反應(yīng)數(shù)N，N=待檢樣本數(shù)(n)+定量標(biāo)準(zhǔn)品(4)+陰性質(zhì)控品(1)+1。計(jì)算加到反應(yīng)混合物中的各個試劑的量，分別添加BKVPCR反 應(yīng) 液 8.5μl×N、BKV 酶 混 合 物 0.5μl×N、BKV PCR 增強(qiáng)劑 10μl×N、BKV 內(nèi)標(biāo)模板 1μl×N。 取無菌離心管配制反應(yīng)體系，試劑全部加入后振蕩15秒，2000r/min離心15s。然后將上述混合液 20μl/管分裝至PCR反應(yīng)管中。(2)PCR反應(yīng)：分別取BKV/JCV陰性質(zhì)控品、已處理樣本和BKV定量標(biāo)準(zhǔn)品I～I(xiàn)V 5μl加入 PCR 反應(yīng)管中，蓋緊管蓋，2000r/min離心15s將管壁上的液體全部甩至管底，如有氣泡輕彈管壁將氣泡彈出，再次離心去除氣泡，然后立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。具體設(shè)置程序見表1。

表1 PCR反應(yīng)條件和程序

1.3.3 PCR數(shù)據(jù)分析 擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測目的片段，并分析熒光擴(kuò)增檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 尿液和血液中BKV-DNA和JCV-DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。

A BKV-DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖1 尿液和血液中BKV、JCV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 尿液、血液中BKV-DNA和JCV-DNA定量檢測結(jié)果 BKV和JCV定量PCR檢測，用4個體外純化質(zhì)粒作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|R|(|r|)均大于0.99。腎移植術(shù)后患者BKV和JCV檢測的最低檢測限為 2×103copies/ml， 線性檢測范圍為 5×103～5×108copies/ml。

BKV-DNA在尿中的檢出率為33.3%(51/153)，載量在 1.15×103~6.00×1011copies/ml之間， 血液中檢出率 為 34.8%(54/155)， 載 量 在 1.3×103~6.06×105copies/ml之間。JCV-DNA在尿中的檢出率為31.3%(47/150)，載量在 1.15×103~6.00×1011copies/ml之間，血液中檢出率為34.6%(54/156)，載量在1.3×103~6.06×105copies/ml之間。發(fā)生病毒尿癥的中位時間為6.1月，發(fā)生病毒血癥的中位時間為4.9月。定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線，見圖2。

圖2 尿液和血液中BKV-DNA、JCV-DNA的PCR擴(kuò)增曲線

2.3 PCR方法的靈敏度和特異性 BKV尿液和血液樣本靈敏度分別為98.31%和99.22%，特異性分別為100%和99.79%；JCV尿液和血液樣本靈敏度分別為97.90%和98.60%，特異性均為100%。本檢測方法對BKV和JCV檢測具有較高的特異性和靈敏度。見表2。

表2 BK病毒和JC病毒檢測試劑的靈敏度和特異性

3 討論

多瘤病毒屬乳多空病毒屬，目前已發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒成員有13個，其中BKV、JCV和SV40與人類有關(guān)。BKV可引起移植腎功能異?；騿适?；JCV可引起進(jìn)行性多灶白質(zhì)腦病(PML)；SV40則為猿類動物病毒。

在腎移植患者，由多瘤病毒感染的臨床表現(xiàn)既可以是病毒尿癥，也可以是明顯的腎臟、泌尿系異常。如輸尿管狹窄、一過性移植腎功能異常、間質(zhì)性腎炎、出血性膀胱炎等，統(tǒng)稱為多瘤病毒相關(guān)性腎病 (Polyomavirus-associatednephropathy,PVAN)。10%～60%的腎移植患者在接受抗排斥治療程中有BKV感染 ，多見于術(shù)后3個月內(nèi)。國外資料顯示，腎移植術(shù)后44周可有約5%的病例發(fā)生PVAN。如無恰當(dāng)?shù)奶幚?，高達(dá)45%的病例在組織學(xué)確診后平均6個月轉(zhuǎn)變?yōu)橐浦材I失功。PVAN的發(fā)生可能與免疫抑制維持治療 (FK506，MMF及雷帕霉素)、腎小管上皮細(xì)胞損傷及再生、抗排斥治療等多因素密切相關(guān)。

BK病毒(BKV)屬多瘤病毒家族成員，感染后多以潛伏狀態(tài)存在，當(dāng)宿主免疫功能低下時可重新激活。BK病毒原發(fā)感染發(fā)生在兒童時期，一般存在于人體泌尿道及外周血白細(xì)胞中，約0.5%～20%感染者會出現(xiàn)BKV激活，導(dǎo)致病毒復(fù)制，一般不會引起腎功能損害。但在接受免疫抑制治療的人群中，特別是腎移植術(shù)后患者，BKV再激活率會明顯增高，并可能導(dǎo)致BKV相關(guān)性腎病(BKV associated nephropathy，BKVAN)。 腎臟是健康人 BKV潛伏感染的主要部位，腎移植術(shù)后患者可在尿液中檢測到BKV，其中多數(shù)患者表現(xiàn)為無癥狀病毒血癥或暫時的移植腎功能異常，偶可在切除的移植腎標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)病毒引起的組織損傷。

近年研究發(fā)現(xiàn)，初次感染BKV后，BKV常潛伏于腎小管上皮細(xì)胞及尿路移行上皮細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)宿主免疫力下降時，BKV可再次激活并開始迅速大量復(fù)制。腎移植術(shù)后患者BKV再次激活的發(fā)生率為10%－68%，約1%－7%的腎移植患者會出現(xiàn)BKVAN，其中50%會導(dǎo)致移植腎失功。

BKV是導(dǎo)致PVAN的主要原因[5]，與JCV具有75%的序列同源性。JCV可引起進(jìn)行性多灶白質(zhì)腦病(PML)，還能在腎臟組織中復(fù)制，并通過尿液排出病毒。器官移植后，免疫抑制劑的使用是誘導(dǎo)多瘤病毒激活復(fù)制的重要原因，其中，40%以上的腎移植患者可檢測到JCV的復(fù)制。據(jù)報(bào)道[6]，大約3%的JCV感染患者可導(dǎo)致PVAN的發(fā)生；但如果JCV與BKV同時發(fā)生感染的患者，PVAN發(fā)生的機(jī)率將上升到15%[7]。目前，尚無有效的抗病毒藥物。普遍的處理方法是恰當(dāng)?shù)卣{(diào)整免疫抑制劑的類型和用量以減少病毒的復(fù)制，但又增加引發(fā)排斥反應(yīng)的風(fēng)險。因此，建立快速、有效的檢測方法，對PVAN的早期預(yù)測和診斷對腎移植患者預(yù)后有著重要的臨床意義。

近年來，相對于其他又創(chuàng)性的檢測，人們更推崇無創(chuàng)性檢測方法，如采用PCR檢測血中病毒DNA。 Toyoda[10]和 Leung[11]等研究證明，BKV 定量PCR測定對于檢測BKV感染的發(fā)病過程非常有效，并建議聯(lián)系臨床現(xiàn)象和活檢所見判斷結(jié)果。PCR法檢測多瘤病毒的敏感性為100%，特異性為88%~95%[12,13]，在組織學(xué)檢查的陰性而PCR陽性的病人最終約有半數(shù)以上病人發(fā)展為PVAN，在這期間具有數(shù)周到數(shù)月的窗口期[14]。尿PCR檢測的靈敏度和特異性更高，但由于誘耳細(xì)胞內(nèi)病毒包涵體可以是BKV或JCV[15]，因此尿脫落細(xì)胞檢測不能作BKV或JCV的特異性分型。實(shí)時熒光定量PCR檢測方法被認(rèn)為是一種檢測病毒載量敏感性較高的非侵入性檢查。在臨床上，對腎移植術(shù)后患者血液和尿液中多瘤病毒進(jìn)行定性、定量實(shí)時監(jiān)測，可作為腎移植術(shù)后BKV相關(guān)性腎病(BKVAN)和多瘤病毒相關(guān)性腎病(PVAN)的早期診斷和篩選的方法。

據(jù)報(bào)道，腎移植受者Decoy細(xì)胞陽性率為29.4%~40.0%，病毒尿癥發(fā)生率為13.0%~34.7%，病毒血癥為5.0%~21.0%。其中病毒尿癥的發(fā)生率與本文檢測結(jié)果基因一致，而病毒血癥的發(fā)生率略高。BKV病毒血癥出現(xiàn)的原因可能有以下幾種：(1)腎小管上皮細(xì)胞的BKV激活后通過小管周的毛細(xì)管進(jìn)入血循環(huán)中；(2)血癥和尿癥是BKV在尿上皮細(xì)胞和外周單核細(xì)胞各自激活的結(jié)果，兩者相互伴隨發(fā)生；(3)BKV病毒尿癥至少在一定程度上是血癥的一個反映，血癥中的病毒經(jīng)過腎代謝進(jìn)入尿中BKVAN。血液中BKV的出現(xiàn)反映了BKVAN的發(fā)展過程。

目前，關(guān)于多瘤病毒的研究報(bào)道很多[16]，但對腎移植患者的BKV和JCV相關(guān)的PVAN、以及移植腎的免疫排斥之間相互作用的研究尚不清楚，相信在不久將來，這方面的研究會成為焦點(diǎn)，為臨床治療不斷提供新的理論依據(jù)。

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