聶益軍，吳紅

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西 南昌330006；2、江西省血液中心,江西 南昌 330077)

糖尿病是一種以高血糖為特點(diǎn)的慢性常見(jiàn)病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。最新的研究認(rèn)為2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病，在其發(fā)生發(fā)展中，P2X7受體在單核/巨噬細(xì)胞上表達(dá)并調(diào)控其細(xì)胞因子的分泌，從而參與并調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)及炎癥過(guò)程[1]。本研究通過(guò)對(duì)2型糖尿病及健康人群進(jìn)行生化檢測(cè)指標(biāo)、血清細(xì)胞因子的比較及P2X7受體在外周血單核細(xì)胞的表達(dá)變化，探討2型糖尿病發(fā)生及進(jìn)展的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院患者38例 (所有病例均按1999年WHO糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)斷)，根據(jù)C反應(yīng)蛋白(CRP,C reactive protein)水平分為CRP正常2型糖尿病組和CRP增高2型糖尿病組；20例正常對(duì)照組來(lái)自江西省血液中心無(wú)償獻(xiàn)血者同年齡段健康人群，均無(wú)糖尿病、高血壓及心腦血管病病史。以上各組均排除其他內(nèi)分泌疾病：心、肝、肺、腦疾病；惡性腫瘤、自身免疫性疾病、風(fēng)濕、類風(fēng)濕疾??；感染性疾病及妊娠等，以上所有人群均簽訂知情同意書，并通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 生化檢測(cè)指標(biāo) 空腹血糖 (fasting plasma glucose,FPG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、 高密度脂蛋白膽固醇 (high density lipoprotein cholesterol，HDLC)、糖化血清蛋白(Glycosylated serum protein)用日立7870全自動(dòng)生化儀測(cè)定;空腹胰島素(fasting plasma insulin，F(xiàn)PI)以時(shí)間分辨免疫熒光法測(cè)定。胰島素抵抗指數(shù)用穩(wěn)態(tài)模型 (HOMA)法計(jì)算:HOMA-IR(homeostasis model assessment–insulin resistance)=FPI(mIU/L)×FPG(mmol/L)/22.5。 CRP 的測(cè)定采用免疫比濁法。

1.3 外周血單核細(xì)胞P2X7受體的表達(dá)

1.3.1 外周血單核細(xì)胞的分離[2]采集每位受檢者EDTA抗凝全血10ml，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離法(北京索萊寶)，按試劑說(shuō)明書操作。EDTA抗凝全血(10ml)與等量Hanks液混合，輕輕加入稀釋血液樣品置于Ficoll分離液上層，在18~22℃下，離心2000r/min，20min，此時(shí)溶液主要分為四層：上層為血漿及血小板，中間白膜層為PBMC，第三層為分離液，第四層為白細(xì)胞和紅細(xì)胞。用無(wú)菌的巴斯德吸管把白膜層細(xì)胞移入無(wú)菌離心管中，加入Hanks液洗滌 1~2次 (18~22℃離心 1500r/min×10min棄去上清液)，以去除血小板。若有RBC則用RBC裂解液裂解，裂解結(jié)束后Hanks液洗2遍。加入3ml完全RPMIl640培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力。以5×106cells/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)2~4h，加入Hanks液洗滌1~2次除去未貼壁的細(xì)胞，貼壁的細(xì)胞即為外周血單核細(xì)胞。

1.3.2 RNA的提取及RT-PCR 單核細(xì)胞培養(yǎng)皿去除上清液后加入1 ml TRIzol(北京天根)混勻,將勻漿樣品在15~30℃放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。移出細(xì)胞裂解物于EP管中,加入0.2mL氯仿,蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。4℃ 12000r/min離心15min,吸取上清至新管加入等體積的異丙醇,混勻，室溫放置20~30min。4℃12000r/min離心10min,在管底部可見(jiàn)微量的RNA沉淀,棄上清，加入1ml75%乙醇(RNase-Free ddH2O配置)洗滌沉淀。4℃ 5,000r/min離心3min。棄去液體，室溫放置晾干3~5min加入20μlRNase-Free ddH2O，反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)A260及A280，要求A260/A280比值介于1.8～2.0,立即按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit,Thermo American)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體操作步驟參照說(shuō)明書。P2X7上游引物序列為5'-AGCTGCAGTGATGTTTTCCA-3',下游引物序列為5'-TCTTCCACTGCCTCGATGG-3',特異性擴(kuò)增片段為508bp;同時(shí)以β-actin為內(nèi)參照物,上游引物序列為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3',下游引物序列為5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3',特異性擴(kuò)增片段為208bp。以上引物均由上海生物工程技術(shù)公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min,94℃變性45s,57℃退火45s,72℃延伸45s，共32個(gè)循環(huán),72℃最后延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并與用凝膠成像儀 (Chemi DocTMXRS Imaging System,BIORAD USA)成像及Image-Pro Plus software軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析(以P2X7與β-actin的條帶積分光密度比值表示其mRNA的表達(dá)水平)。

1.4 血清細(xì)胞因子檢測(cè) 收集受檢者的血清進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)。血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、 白介素-10(interleukin-10,IL-10)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)，按照試劑盒(上海森雄)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。對(duì)所測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般生化檢測(cè)指標(biāo) 表1結(jié)果顯示：2型糖尿病組在空腹血糖、餐后血糖、糖化血清蛋白、穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)及甘油三酯、膽固醇均明顯高于正常對(duì)照組間(P<0.05)，而CRP升高2型糖尿病組在CRP、空腹胰島素及穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)均明顯高于其他2組(P<0.05)，其它數(shù)據(jù)其差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 2型糖尿組與正常對(duì)照組一般情況比較

2.2 P2X7受體的mRNA表達(dá)水平 2型糖尿病組患者P2X7受體基因的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，而CRP正常2型糖尿病組及CRP升高2型糖尿病組之間無(wú)顯著性差異。具體結(jié)果見(jiàn)表2及圖1。

表2 2型糖尿病組與正常對(duì)照組P2X7受體的mRNA表達(dá)水平

圖1 2型糖尿病組與正常對(duì)照組P2X7受體的mRNA表達(dá)水平

2.3 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 2型糖尿病患者的TNF-α、IL-1β的水平明顯高于正常對(duì)照組，同時(shí)TNF-α及IL-1β的水平在CRP升高2型糖尿病組也明顯高于CRP正常2型糖尿病組。IL-10在CRP升高2型糖尿病組的水平顯著低于其他2組。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 2型糖尿病組與正常對(duì)照組血清炎癥因子水平比較

3 討論

糖尿病是一種以高血糖為特點(diǎn)的慢性常見(jiàn)病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。一般認(rèn)為1型糖尿病是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致了胰島β細(xì)胞的進(jìn)行性破壞，而2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制更為復(fù)雜,主要體現(xiàn)在胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)及胰島素分泌缺陷。最新的研究認(rèn)為2型糖尿病是一種自身免疫和低度炎癥性疾病。美國(guó)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),血清C反應(yīng)蛋白升高者的2型糖尿病患病率增加2～3倍[3]，另一項(xiàng)前瞻性研究也顯示,C反應(yīng)蛋白和IL-6對(duì)2型糖尿病發(fā)病的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為15.7和7.5[4]。作為急性炎癥時(shí)最敏感的蛋白指標(biāo)之一的CRP,其半衰期長(zhǎng)且在血清中穩(wěn)定,是最常用的急性相反應(yīng)蛋白。CRP是由肝臟合成的,主要受血循環(huán)IL-6、TNF-α調(diào)節(jié),反過(guò)來(lái)CRP也可以刺激單核細(xì)胞釋放 IL-6、IL-1β、TNF-α,介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子等,發(fā)揮致炎作用。胰島素可抑制肝臟合成CRP,而胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,胰島素敏感性降低,對(duì)肝臟合成CRP的抑制作用減弱,可能是糖尿病患者血清CRP升高的部分原因[5]。本次研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的血脂水平 (甘油三酯和膽固醇)均明顯高于正常人；CRP升高糖尿病患者除空腹胰島素外，其穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)也顯著高于CRP正常人群。以上結(jié)果說(shuō)明在2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程中血脂是其危險(xiǎn)因素之一[6]，CRP的升高可能與胰島素抵抗之間存在一定的關(guān)聯(lián)。

嘌呤受體分為P1和P2受體兩大類,P1受體主要由腺苷激活,屬G蛋白耦聯(lián)受體家族,包括A1、A2A、A2B、A3四類。 P2受體主要由核苷酸激活,包括P2X和P2Y兩類，已有7種P2X受體(P2X1-7) 和 8 種 P2Y 受 體(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11-14)亞型被克隆[7，8]。 ATP 可作用于單核/巨噬細(xì)胞引起信號(hào)分子和組織因子的激活，功能上與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞因子及促炎性分子的表達(dá)和分泌有關(guān)[9，10]。單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)功能性P2X7受體，當(dāng)ATP激活P2X7受體后介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的K+外流，胞內(nèi)K+濃度的降低誘導(dǎo)NF-κB介導(dǎo)的caspase-l活化，在caspase-l的酶切作用下IL-1β前體蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒祗w；同時(shí)胞內(nèi)K+濃度的降低也使得Ca2+非依賴性的磷脂酶A2活性升高，從而誘導(dǎo)分泌溶酶體內(nèi)的IL-1β釋放到胞漿中[11]。P2X7受體激活后形成的較大孔徑通道，允許IL-1β成熟體釋放至胞外[12]。而IL-1β是炎癥反應(yīng)過(guò)程中的一個(gè)重要因子，可由多種細(xì)胞(包括活化的單核/巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生未成熟的IL-1前體，該前體經(jīng)水解酶裂解后能生成成熟的具有生物活性的IL-1細(xì)胞因子。IL-1β是IL-1家族中最重要的細(xì)胞因子，在機(jī)體對(duì)感染、損傷以及免疫應(yīng)答中起重要作用，也是急、慢性炎癥反應(yīng)的主要介導(dǎo)因子[11]。TNF-α及IL-10均可由單核/巨噬細(xì)胞分泌，而且均可調(diào)節(jié)機(jī)體組織糖、脂肪代謝。其中TNF-α可直接對(duì)脂肪、肌肉細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起抑制作用，使其表達(dá)減少、功能減退。當(dāng)葡萄糖代謝通路被TNF-α選擇性削弱時(shí)，將導(dǎo)致高胰島素血癥[13]。而IL-10通過(guò)抑制炎性反應(yīng),可預(yù)防代謝綜合征和2型糖尿病的發(fā)生。IL-10生成能力降低增加了罹患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[14]。因此血清中的細(xì)胞因子與2型糖尿病的發(fā)生或進(jìn)展有著密切的關(guān)聯(lián)。本次研究證實(shí)外周血單核細(xì)胞表達(dá)P2X7受體基因，而且在2型糖尿病患者的P2X7受體mRNA的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于正常健康人群(圖1及表2)[15]。與此同時(shí)血清中的炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)在正常人群、CRP正常2型糖尿病組及CRP升高2型糖尿病患者逐漸顯著升高(均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3)；CRP升高2型糖尿病患者的抗炎性細(xì)胞因子(IL-10)較其他兩組顯著降低，而正常人群、CRP正常2型糖尿病組之間則無(wú)顯著性差異(見(jiàn)表3)。以上結(jié)果表明單核細(xì)胞通過(guò)機(jī)體免疫反應(yīng)提高P2X7受體的表達(dá)以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的改變，從而調(diào)控2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本次結(jié)果顯示2型糖尿病患者血清炎癥因子水平及單核細(xì)胞P2X7受體的表達(dá)均升高,提示2型糖尿病患者處于免疫炎癥狀態(tài),其血清炎癥因子水平、CRP含量及P2X7受體的表達(dá)升高可能與胰島素抵抗的形成有關(guān)，從而從分子水平上探討了2型糖尿病發(fā)生及進(jìn)展的可能機(jī)制。

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