陳潔，王健

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，1、病理科；2、檢驗科，江西 南昌330006)

CD137/CD137L是除CD28/B7之外的另一對重要的共刺激分子，在免疫細胞之間進行雙向信號傳導(dǎo)，在免疫應(yīng)答、抗腫瘤免疫和自身免疫性疾病中起重要作用[1]。CD137L屬于腫瘤壞死因子超家族9，是腫瘤壞死因子家族的一員，它主要表達在抗原呈遞細胞(APC)，成熟的樹突狀細胞，也可表達于活化的B細胞和巨噬細胞等[2]。CD137信號傳導(dǎo)途徑既能提供刺激信號激活T細胞，使T細胞活化增殖分泌細胞因子，在誘導(dǎo)這種刺激信號的同時它也介導(dǎo)反向刺激信號，誘導(dǎo)APC活化增殖和分泌細胞因子，這種雙向信號傳導(dǎo)更加迅速和精確地調(diào)節(jié)機體的生物反應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)CD137L除了高表達于淋巴或骨髓來源的腫瘤細胞表面，還表達于多種實體瘤細胞株表面，如Colo205、PC3、SKBR3等腫瘤細胞株[4]。本研究采用實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)染色方法檢測食管癌組織及癌旁組織中CD137L的表達，探討CD137L在食管癌組織及癌旁組織中的表達差異及CD137L的表達水平與食管癌的臨床病理特征、預(yù)后等臨床參數(shù)之間的關(guān)系，揭示CD137L在食管癌發(fā)生進展中的作用，為尋找食管癌新的分子標志物及治療靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院和江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2010年1月至2013年12月期間經(jīng)手術(shù)切除病理診斷為食管鱗狀細胞癌的石蠟標本31例，購買食管鱗狀細胞癌組織芯片30例，癌旁組織30例。其中男性36例，女性25例，年齡25~78歲，中位年齡59歲。這些標本用于免疫組化實驗。收集華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院2014年5月至12月手術(shù)切除的食管癌組織18例，正常食管組織3例，經(jīng)福爾馬林浸泡時間均小于5h，采集未直接接觸福爾馬林的黃豆大小的癌組織、癌旁組織及正常食管組織，置-80℃冰箱保存。這些標本用于RT-PCR實驗。(癌旁組織是指距離癌組織邊緣1㎝以上沒有癌組織的正常食管組織)

1.2 試劑和方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)檢測CD137L在食管癌中的表達。61例食管癌組織標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。兔抗人CD137L單克隆抗體和SP試劑盒均購自武漢博士德公司，具體實驗步驟按試劑盒操作說明書進行。每次染色均用PBS替代一抗作為陰性對照。組織芯片購自于上海芯超公司。

RT-PCR所用的試劑盒主要有固定組織RNA提取試劑盒、HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture等均購自康為世紀生物技術(shù)有限公司，Real Time PCR擴增儀為美國ABI公司生產(chǎn)。引物由上海生工合成。

1.3 總RNA提取及cDNA合成 根據(jù)固定組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，提取產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳確定RNA質(zhì)量，使用紫外分光光度計檢測總RNA的純度并計算濃度。根據(jù)HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA。先去除基因組DNA反應(yīng)，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成條件 37℃孵育 15min，85℃孵育 5s。合成產(chǎn)物進行下一步熒光定量PCR。

1.4 實時熒光定量PCR β-actin上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′， 下 游 引 物 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴增產(chǎn)物186bp；CD137L 上 游 引 物 5′ -CATGTTTGCGCAGCTGGTG-3′, 下 游 引 物 5′-CGCCGCAGCTCTAGTTGAAAG-3′, 擴增產(chǎn)物 183bp。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl：2xUltraSYBR Mixture(with ROX)12.5μl，上、下游引物混合物 1.5μl，模板cDNA1μl，RNase-Free Water10μl。PCR 反應(yīng)條件為95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40cycles。 融解曲線分析 95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。 每個cDNA標本進行三次PCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)以x±s表示，最后結(jié)果按公式:2－△△Ct進行計算。

1.5 免疫組化結(jié)果判定CD137L蛋白表達定位于細胞質(zhì)和細胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒。結(jié)果判定：每例標本在高倍鏡視野下隨意觀察5個視野。CD137L染色強度評分為：0 分(沒著色)，1 分(弱)，2 分(中等)，3分(強)。 陽性細胞的百分比評分為：0 分(≤1%)，1 分(1%~10%)，2 分(10%-50%)，3 分(≥50)。 將兩者分數(shù)疊加后分數(shù)＞4分即為陽性，0-3分為陰性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計均用SPSS18.0軟件完成。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，臨床病理參數(shù)組間數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05時各組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中CD137L的分布和表達CD137L陽性表達定位于細胞質(zhì)和細胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1)。在61例食管癌組織中32例陽性，表達率為52.5%，而鄰近的癌旁組織中呈陰性表達或者弱陽性的非特異性表達(圖2)。

圖1 CD137L在食管癌組織中表達陽性(×400)

圖2 CD137L在癌旁組織中表達陰性(×400)

2.2 與臨床病理資料的聯(lián)系 將61例食管癌患者按性別、年齡、腫瘤分化程度和分期等分組進行分析，結(jié)果顯示，CD137L的表達在中-高分化的食管鱗狀細胞癌中的陽性率高于低分化的鱗狀細胞癌(P=0.001)，在早期食管癌中的表達高于進展期食管癌(P=0.048)，與其他因素?zé)o明顯相關(guān)，P>0.05(表 1)。

2.3 總RNA電泳圖 將提取的RNA產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，可以清晰地看到28s、18s和5s三條帶，說明提取的RNA質(zhì)量可靠，可以進行下一步的RT-PCR實驗。見圖3。

2.4 食管癌組織中CD137LmRNA的表達 各實驗組CD137L和內(nèi)參β-actin擴增產(chǎn)物的Ct值見表2。食管癌組織中CD137L mRNA的相對表達量為0.075±0.355，高于癌旁組織的相對表達量0.031±0.383(P<0.05)。

表1 食管癌組織CD137L的表達與臨床病理資料的聯(lián)系

表2 實時熒光定量PCR檢測食管癌組織CD137LmRNA的表達

圖3 RNA1%瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

食管癌是世界上常見的八大惡性腫瘤之一，對人類的健康構(gòu)成了嚴重的威脅。研究顯示食管癌在國際上的發(fā)病率居惡性腫瘤發(fā)病率的第九位，死亡率居第八位。而我國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，特別是北方地區(qū)河南省一帶，以食管鱗狀細胞癌最為常見，全國每年發(fā)病人數(shù)約25.9萬人，占全世界每年發(fā)病人數(shù)的一半以上，發(fā)病率居全國惡性腫瘤第五位，死亡率居第四位[5,6]。到目前為止，食管癌的確切病因尚未完全明了，哪些因素與食管癌的生存和預(yù)后相關(guān)，以及尋找治療食管癌的新的方法等等都是我們迫切需要解決的問題。

通過對CD137/CD137L信號傳導(dǎo)途徑研究發(fā)現(xiàn)，CD137L作用于CD137后可以通過 TRAF2、TRAF1和MAPK等途徑傳導(dǎo)細胞內(nèi)信號，調(diào)節(jié)細胞因子的釋放以及調(diào)控單核細胞的增殖和分化等，影響生物學(xué)行為。可以促進腫瘤特異性T細胞的活化、增殖，細胞因子分泌增加，保護T細胞免于活化誘導(dǎo)的細胞死亡 (activation-induced cell death，AICD)[7-9]。同時它也介導(dǎo)反向共刺激信號，因此能誘導(dǎo)APC活化增殖和分泌細胞因子。誘導(dǎo)單核細胞分泌細胞因子M-CSF，促進單核細胞的增殖，延長其生存；促進炎性因子 IL-6、IL-8、TNF-α的分泌，抑制抗炎性因子IL-10的分泌等[10]。其中IL-8是炎細胞趨化因子，參與白細胞聚集,也是許多惡性腫瘤的生長因子[11]。T細胞與巨噬細胞通過CD137/CD137L雙向作用而相互活化，介導(dǎo)雙向信號傳導(dǎo)，促進免疫反應(yīng)。

CD137/CD137L除了表達在免疫細胞也可以表達在其他非免疫細胞。Salih HR等研究發(fā)現(xiàn)人的不同癌細胞株和來源于這些細胞株的實體瘤及人體腫瘤細胞上均有CD137L的表達[4]。還有人研究了結(jié)腸癌、肺癌、淋巴瘤和肝癌等腫瘤細胞株，發(fā)現(xiàn)這些細胞不同程度地表達CD137L[12]，這與Salih HR等研究結(jié)果一致，說明CD137L在腫瘤細胞上的表達是普遍現(xiàn)象。在人類惡性血液疾病中，CD137L能將生長和生存信號轉(zhuǎn)換給腫瘤細胞而且還能引發(fā)抑制腫瘤生長的回應(yīng)[13,14]。

一般認為在腫瘤的發(fā)生和進展過程中，腫瘤組織通常低表達或不表達共刺激分子從而逃避機體免疫系統(tǒng)的識別。多種惡性腫瘤細胞株均表達CD137L，并且該分子具有的生物學(xué)活性，能促使腫瘤細胞增殖、分泌IL-8，降低細胞凋亡，減弱抗癌藥物的細胞毒效應(yīng)。另一方面通過結(jié)合CD137，能促進T細胞分泌IFN-γ,抑制增殖促進凋亡。CD137L表達于多種人體惡性腫瘤組織細胞表面，CD137則表達于腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞，這一對共刺激分子通過雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對腫瘤的發(fā)生進展及轉(zhuǎn)移可能具有特殊的生物學(xué)意義。CD137L作為共刺激分子，因其逆向信號的存在，使它的作用不單是提供第二信號引起T細胞活化的功能[15]。研究表明 CD137L參與腫瘤的發(fā)展，通過與CD137交聯(lián)向表達CD137L的腫瘤細胞傳遞逆向信號，產(chǎn)生的效應(yīng)可以是增強免疫，最近關(guān)于CD137L在非小細胞肺癌中的作用的研究證明了這一點[16]。也可以使機體腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，影響機體免疫功能。有研究顯示CD137L是診斷非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤的一個新的標記,它的表達可以作為免疫治療淋巴瘤或其他惡性腫瘤的靶點[17]。因此，進一步研究CD137L參與腫瘤發(fā)展的機制使CD137L可能成為抗腫瘤免疫治療的一個靶標。

本研究中，我們運用免疫組化的方法檢測61例食管癌組織及30例癌旁組織CD137L蛋白的表達情況，結(jié)果顯示食管癌組織中CD137L的表達為陽性，在癌旁組織中的表達為陰性。CD137L表達在食管癌細胞的細胞膜及細胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。同時運用實時熒光定量RT-PCR方法檢測18例食管癌組織及癌旁組織中CD137LmRNA的表達，結(jié)果顯示癌組織中CD137LmRNA的表達水平高于癌旁組織。CD137L蛋白的表達在中-高分化的食管鱗狀細胞癌中的陽性率高于低分化的鱗狀細胞癌(P=0.001)，在早期食管癌中的表達高于進展期食管癌(P=0.048)。中-高分化的鱗狀細胞癌和早期的食管癌的預(yù)后均要好于低分化鱗狀細胞癌和進展期食管癌。提示CD137L對預(yù)后有一定的影響，高表達CD137L的食管癌患者預(yù)后要相對較好。作用機制可能是CD137L和CD137相互作用向表達CD137L的腫瘤細胞傳遞逆向信號產(chǎn)生增強免疫的效應(yīng)，而具體的作用途徑有待進一步研究。由本文的結(jié)果推斷CD137L可以作為食管癌一個新的診斷標記和治療靶點。

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