朱義保，謝彤，楊亮亮，萬磊

(江西省婦幼保健院，江西 南昌 330006)

大量的流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究資料表明，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染與宮頸癌及癌前病變關(guān)系密切，是宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)在HPV致癌過程中，常發(fā)生HPV E2基因的缺陷，E2完整性遭到破壞，引起致癌性基因E6、E7過量表達(dá)，高表達(dá)的E6和E7通過與細(xì)胞抑癌基因P53和Rb蛋白產(chǎn)物作用并使之失活，導(dǎo)致細(xì)胞無限制生長進(jìn)而引起癌變[1]。因此在本課題中，我們以感染HPFV16的不同宮頸病變?yōu)闃?biāo)本，提取DNA，用定量PCR的方法分析HPV16 E2/E7的比值，描述病毒的存在狀態(tài)，探討病毒整合與宮頸病變程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇來我院診治的住院患者，用塑料毛刷取樣器采集宮頸脫落細(xì)胞，根據(jù)患者的病理結(jié)果和HPV16感染情況，選取慢性宮頸炎21例，CINⅠ4例，CINⅡ22例，CINⅢ 23例，宮頸癌28例。這些患者無子宮切除術(shù)史、無急性生殖道炎癥、無盆腔放射治療史、無細(xì)胞學(xué)檢查異?；?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變史、非月經(jīng)期、非孕期、患者檢查前24h未進(jìn)行性生活、藥水沖洗及陰道用藥等。

1.2 主要試劑及儀器 HPV16質(zhì)粒(P1203)由美國Addgene公司惠贈(zèng)。DNA提起試劑盒、質(zhì)粒提取試劑 盒 、PCR 試 劑 、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑等購自為北京天為時(shí)代公司，ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀為美國Applied Biosystems產(chǎn)品。

1.3 DNA提取 從宮頸管采樣，樣品分2份，一份做人乳頭瘤病毒分型檢測，另一份備用，對(duì)于人乳頭瘤病毒分型檢測HPV16陽性的標(biāo)本，取相應(yīng)的備用樣品提取DNA，相關(guān)步驟參見北京天為DNA提取試劑盒。為確認(rèn)樣品HPV16的感染，對(duì)提取后的DNA進(jìn)行HPV16 E7基因擴(kuò)增，通過凝膠電泳確認(rèn)樣品存在HPV16感染。

1.4 E2和E7基因定量PCR擴(kuò)增條件 引物由華大基因公司合成，HPV16 E2上游引物 5’-TGCGCCTAGAATGTGCTATTTA-3’，下游引物 5’-TCTTTGATACAGCCAGTGTTGG-3’，擴(kuò)增片度長93bp；HPV16 E7 上游引物 5’-TGCAACCAGAGACAACTGAT-3’，下游引物 5’-TGTCTACGTGTGTGCTTTGT-3’，擴(kuò)增片段長183bp?？偡磻?yīng)體系為20μl， 包括 2μl DNA 模板，0.5μl正反引物，10μl SuperReal PreMix Plus， 加 ddH2O 至 20μl， 定量PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性15min，95℃變性10s，57℃復(fù)性20s，72℃延伸20s，40次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、游離型和混合型HPV16的界 定 及 標(biāo) 本 測 定 以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl 的 HPV16質(zhì)粒為模板，每個(gè)濃度檢測6次，對(duì)E2和E7基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取不同批次不同濃度下E2和E7基因的CT均數(shù)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并取同批次不同濃度下E2/E7比值95%參考值的下限，作為區(qū)分游離型和混合型HPV16的臨界值；樣品DNA根據(jù)E2和E7基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算E2和E7基因的量，得出各自E2/E7的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SSPS17.0軟件 應(yīng)用t檢驗(yàn)、卡方分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E2和E7基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 為保證數(shù)據(jù)的可靠性，我們重復(fù)了 6次以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl的HPV16質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)濃度的檢測，計(jì)算不同批次不同濃度下E2和E7基因CT值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，在基礎(chǔ)上以E2和E7 CT值的平均值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖1所示，E2和E7基因擴(kuò)增曲線良好，實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.97，表明Ct值與起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值線性關(guān)系良好，6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)均數(shù)小于4%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

圖1 E2和E7基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 HPV16存在狀態(tài)的認(rèn)定 在HPV16整合過程中，E2基因常缺失，理論上可認(rèn)定E2/E7＝1是游離型，0＜E2/E7＜1 為游離和整合的混合型，E2/E7＝0為整合型，但在E2和E7基因的實(shí)際擴(kuò)增中，可存在一定隨機(jī)誤差，游離狀態(tài)下E2/E7比值會(huì)在1上 下 浮 動(dòng)[6,7]， 因 此 以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl 的 HPV16質(zhì)粒為模板，每個(gè)濃度檢測6次，得到了30個(gè)E2/E7比值，所得值介于0.76～1.24之間，95%參考值范圍為 1.04±0.27，即 0.77～1.31，因此本研究所采用以下標(biāo)準(zhǔn)來判斷HPV16的存在狀態(tài)，認(rèn)為：E2/E7=0為整合型，E2/E7≥0.77為游離型，0

2.3 HPV16存在狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)系 根據(jù)上述HPV16認(rèn)定存在狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌HPV16的整合率分別為 4.00%、9.09%、13.04%、10.71%， 統(tǒng)計(jì)顯示HPV16整合率在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌中分布的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.55)；因混合型HPV16中也有病毒的整合，因此把混合型與整合型HPV16合并，得出HPV16總整合率分別為 48.00%、59.09%、65.22%、75.00%， 分析顯示HPV16總整合率在各宮頸病變程度間亦不顯著(P=0.23)，HPV16總整合率在宮頸病變的分布亦無差異。見圖2。

圖2 不同宮頸病變的HPV16狀態(tài)分布

3 討論

人乳頭瘤病毒的感染是宮頸癌發(fā)生的致病因素，目前對(duì)HPV類型及數(shù)量的檢測有重要的應(yīng)用價(jià)值，但其對(duì)預(yù)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后作用不大[2]。高危型HPV的持續(xù)感染，病毒DNA會(huì)整合入宿主細(xì)胞染色體脆性部位，導(dǎo)致病毒基因表達(dá)的失調(diào)、宿主基因的不穩(wěn)定甚至細(xì)胞癌基因的激活[3]，因此研究HPV病毒整合對(duì)探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，及預(yù)測宮頸病變的轉(zhuǎn)歸有重要意義。在本課題中，我們以感染HPFV16的不同宮頸病變?yōu)閷?duì)象，用定量PCR方法分析HPV16整合情況，描述病毒的存在狀態(tài)，探討HPV16病毒整合與不同宮頸病變的關(guān)系。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)慢性宮頸炎/CINⅠ的HPV16整合率為4.00%，CINⅡ?yàn)?.09%，CINⅢ為13.04%，宮頸癌為10.71%%，HPV16整合率在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的分布沒有差別，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因混合型HPV16也存在病毒整合，把整合型和混合型HPV16合并，合并后的的HPV16總整合率在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌分別為48.00%、59.09%、65.22%、75.00%，統(tǒng)計(jì)顯示HPV16總整合率在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的分布中同樣沒有差別，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的結(jié)論同國內(nèi)報(bào)道相反[4-6]，同國外報(bào)道一致[7，8]，病毒整合率雖隨宮頸病變級(jí)別升高而增加，但病毒整合與宮頸病變無關(guān)。因此我們認(rèn)為，HPV16病毒整合和宮頸病變關(guān)系不明顯，在宮頸病變早期HPV16就有48.00%的整合率，表明宮頸病變早期就有HPV16整合發(fā)生，病毒整合是宮頸病變的早期事件[9]。

近年來腫瘤形成學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是由腫瘤干細(xì)胞引起的。20世紀(jì)歐洲的病理學(xué)家就觀察到腫瘤是由處于各個(gè)分化階段的腫瘤細(xì)胞組成的一個(gè)非均勻混合物，類似于一個(gè)正常的器官。研究者們此后在一系列的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有小部分腫瘤細(xì)胞具有自我更新能力，其他腫瘤細(xì)胞不具有這種能力，如白血病、骨髓瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌等小部分腫瘤細(xì)胞能克隆形成集落，僅有這小部分腫瘤細(xì)胞在適當(dāng)?shù)耐饨缧盘?hào)刺激下能形成腫瘤[10-12]，因而提出了腫瘤干細(xì)胞的學(xué)說?，F(xiàn)已有學(xué)者從宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞系中提取到了的宮頸癌干細(xì)胞[13,14]。

目前研究認(rèn)為宮頸癌干細(xì)胞傾向于來源能向柱狀上皮或鱗狀上皮分化的儲(chǔ)備細(xì)胞，如在同一張切片上，或同一宮頸組織的連續(xù)切片上，能觀察到儲(chǔ)備細(xì)胞增殖、增生、化生、非典型增生直至癌變的各個(gè)階段的連續(xù)性和過渡性的組織學(xué)圖像，提取到的宮頸癌干細(xì)胞也表達(dá)儲(chǔ)備細(xì)胞標(biāo)志角蛋白CK17等[13,15,16]。因此，結(jié)合腫瘤干細(xì)胞理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為只有發(fā)生了HPV整合的儲(chǔ)備細(xì)胞才有可能發(fā)生宮頸病變。在宮頸病變的標(biāo)本中，樣品可能含有儲(chǔ)備細(xì)胞，但也有鱗狀上皮細(xì)胞或柱狀上皮細(xì)胞，特別是早期宮頸病變樣本。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明早期宮頸病變即有高頻率的病毒整合，提示除了儲(chǔ)備細(xì)胞與HPV16發(fā)生整合外，鱗狀上皮細(xì)胞或柱狀上皮細(xì)胞也可能會(huì)與HPV16發(fā)生整合，因?yàn)榇嬖谏掀ぜ?xì)胞的整合干擾，這可能是HPV16整合與宮頸病變關(guān)系不明顯的原因。而且，這種現(xiàn)象也提示，分化成熟的上皮細(xì)胞雖發(fā)生了病毒整合，也難以獲得惡性表型，只有未分化的發(fā)生病毒整合的儲(chǔ)備細(xì)胞才有可能發(fā)生惡變，進(jìn)一步表明了宮頸癌干細(xì)胞來源的問題。

綜上所述，我們認(rèn)為鱗狀上皮細(xì)胞或柱狀上皮細(xì)胞也能與HPV16發(fā)生整合，病毒整合是宮頸病變的早期事件，HPV16整合與宮頸病變程度沒有明顯的關(guān)系。

[1]Nguyen HP,Ramírez-Fort MK,Rady PL.The biology of human papillomaviruses[J].Curr Probl Dermatol,2014,45:19-32.

[2]張勁豐,安宏亮.高危型HPV病毒含量與宮頸癌前病變程度的關(guān)系研究[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(6):535-542.

[3]Lee CA.Human papillomavirus(HPV)and cervical cancer[J].J Insur Med,2012,43(3):178-181.

[4]梁潔瓊,趙敏.高危型人乳頭瘤病毒整合態(tài)與宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌關(guān)系的探討[J].中國藥物與臨床,2014,14(4):431-433.

[5]彭娟,馬莉,王焰.人類乳頭瘤病毒18整合狀態(tài)與宮頸癌及癌前病變的關(guān)系[J].微循環(huán)學(xué)雜志,2013,23(4):40-44.

[6]Li Y,Xiang Y,Zhang RF,et al.Viral load,genomic integration frequency of human papillomavirus 16 in cervical cancer and precancerous lesions[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2011,91(13):906-910.

[7]Manawapat A,Stubenrauch F,Russ R,et al.Physical state and viral load as predictive biomarkersfor persistence and progression of HPV16-positive cervical lesions:results from a population based long-term prospective cohort study[J].Am J Cancer Res,2012,2(2):192-203.

[8]Zubillaga-Guerrero MI,Illades-Aguiar B,Leyva-Vazquez MA,et al.The integration of HR-HPV increases the expression of cyclins A and E in cytologies with and without low-grade lesions[J].J Cytol,2013,30(1):1-7.

[9]Collins SI,Constandinou-Williams C,Wen K,et al.Disruption of the E2 Gene Is a Common and Early Event in the Natural History of Cervical Human Papillomavirus Infection:A Longitudinal Cohort Study[J].Cancer Res,2009,69(9):3828-3382.

[10]肖松舒,蔣建發(fā),薛敏.宮頸癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展.2013,22(9):756-758.

[11]Ricci-Vitiani L,Lombardi DG,Pilozzi E,et al.dentification and expansion of human colon-cancer-initiating cells[J].Nature,2007,445(7123):111-115.

[12]Arvelo F,Cotte C,Sojo F.Stem cells and cancer[J].Invest Clin,2014,55(4):371-391.

[13]Wang L,Guo H,Lin C,et al.Enrichment and characterization of cancer stem like cells from a cervical cancer cell line[J].Mol Med Rep,2014,9(6):2117-2123.

[14]López J,Poitevin A,Mendoza-Martínez V,et al.Cancer-initiating cells derived from established cervical cell lines exhibit stem-cell markers and increased radioresistance[J].BMC Cancer,2012,12:48.

[15]張松靈,費(fèi)軍偉,王毅.宮頸癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].中國婦幼保健,2010,25(13):1872-1874.

[16]Villanueva-Toledo J,Ponciano-Gómez A,Ortiz-Sánchez E,et al.Side populations from cervical-cancer-derived cell lines have stem-cell-like properties[J].Mol Biol Rep,2014,41(4):1993-2004.