李曲文，鄭恩惠，陳愛平，楊勁松，原靈，王靈嵐

(1、福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州350001；2、福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350001)

軍團(tuán)菌是一類革蘭陰性菌，軍團(tuán)菌在許多環(huán)境中都很常見，目前已知的軍團(tuán)菌屬有58個(gè)種70多個(gè)血清型，其中能引起人類疾病的大概有20種,致病性最強(qiáng)的為嗜肺軍團(tuán)菌[1-3]。軍團(tuán)菌的整個(gè)致病過程是其基因組上各個(gè)毒力基因及其表達(dá)產(chǎn)物共同作用的結(jié)果,不同軍團(tuán)菌的致病力強(qiáng)弱與其所帶毒力因子不同有關(guān)[4,5]，有些毒力因子成為了近年來(lái)的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。本文利用PCR方法擴(kuò)增2012-2013年30株軍團(tuán)菌菌株分析毒力島magA基因攜帶情況，以初步了解我省分離株的毒力島magA基因攜帶率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株 2012年-2013年福建省中央空調(diào)冷卻塔水系統(tǒng)軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)分離的菌株30株軍團(tuán)菌菌株。其中 16株 LP1，2株 LP4，3株 LP5，5株LP7，4 株 N-LP。

1.2 試劑儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為BioAsia分裝品。Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，Basic電泳儀，PCR擴(kuò)增儀為G-Storm(英國(guó)GeneTech公司)。

1.3 基因引物 本研究所用的基因引物序列magA基因：F:5’-CTCTATCGCTAACGCACAAGG-3’ R:5’-CGTTGAAGTAGTTAGTGAAAG-3’，參考文獻(xiàn)[5],其相應(yīng)的擴(kuò)增片段大小為469bp，寡核苷酸由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 模板的制備 分純的細(xì)菌菌落，直接刮取適量于300μl的純水制備成菌懸液，100℃煮沸裂解10 min，10000r/min離心5min，取上清做為PCR檢測(cè)的DNA模板。

1.5 PCR反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)均采用20μl的反應(yīng)體系，各組成成分的終濃度分別為：rTaq DNA聚合酶 0.5 U，dNTP 200μmol/L， 上游引物0.4μmol/L，下游引物 0.4μmol/L，DNA 模板 3μl。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果 30株軍團(tuán)菌菌株magA基因PCR檢測(cè)電泳結(jié)果，見圖1。

2.2福建省30株軍團(tuán)菌magA基因攜帶率情況見表1。

圖1 PCR電泳結(jié)果圖

3 討論

軍團(tuán)菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)致病菌，軍團(tuán)菌屬的致病性主要通過細(xì)菌的胞內(nèi)生命循環(huán)過程、毒力島基因座及毒力基因來(lái)完成。嗜肺軍團(tuán)菌的致病性與其毒力攜帶情況密切相關(guān)，毒力基因可以增加了細(xì)菌的生存的適應(yīng)性，是細(xì)菌演變及其致病性的關(guān)鍵元素之一[6-8]。毒力島作為細(xì)菌染色體上一段具有典型結(jié)構(gòu)特征的基因簇,毒力島的形成是通過細(xì)菌基因組水平的轉(zhuǎn)移而改變其特性，可以增加細(xì)菌的適應(yīng)性，是細(xì)菌演變及致病性的關(guān)鍵，與軍團(tuán)菌多種致病菌的毒力因子的產(chǎn)生和細(xì)菌的進(jìn)化有著密切的聯(lián)系[9-11]。嗜肺軍團(tuán)菌含有一個(gè)65kb的毒力島,該毒力島共含有約70個(gè)不同的基因。該基因座包含Ⅳ型分泌系統(tǒng)、易變遺傳因子和毒力因子等，是嗜肺軍團(tuán)菌血清型1(LP1)所特有的[12]。

本研究選用毒力島基因中間的magA(MIF associatied gene)基因作為檢測(cè)毒力島目的基因，magA基因是毒力島70個(gè)基因中的第17個(gè),它編碼的20~24kDa的magA蛋白,據(jù)推測(cè)是表達(dá)軍團(tuán)菌在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)晚期的特異性蛋白,可以作為檢測(cè)細(xì)菌在體內(nèi)細(xì)胞中生長(zhǎng)狀態(tài)的有用標(biāo)記物[13]。本實(shí)驗(yàn)不但檢測(cè)了嗜肺軍團(tuán)菌LP1血清型毒力島攜帶情況，同時(shí)還檢測(cè)了14株非LP1型。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示16株LP1毒力島陽(yáng)性10株，2株LP4均陽(yáng)性，5株LP7陽(yáng)性3株，4株非嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性1株。30株軍團(tuán)菌菌株毒力島攜帶率為53.33%(16/30),說明了我省環(huán)境分離菌株具有較強(qiáng)的致病力，對(duì)環(huán)境有較好的適應(yīng)性，可在外環(huán)境中長(zhǎng)期存活。同時(shí)這些數(shù)據(jù)還表明毒力島并不是嗜肺軍團(tuán)菌LP1所特有的，其他血清型也可攜帶。各部門應(yīng)按照衛(wèi)生部公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范[14,15]，加強(qiáng)中央空調(diào)冷卻塔水監(jiān)測(cè)，以防軍團(tuán)菌病的發(fā)生。

[1]朱慶義,宋亞軍,邵祝軍,等.軍團(tuán)菌和軍團(tuán)菌病[M].北京:科學(xué)出版社,2014:8-10.

[2]原靈,陳愛平,詹鑾峰,等.2008年福建省5設(shè)區(qū)市公共場(chǎng)所中央空調(diào)冷卻塔水軍團(tuán)菌污染狀況調(diào)查 [J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2010,26(11):1080-1082.

[3]李曲文,原靈,陳愛平,等.1株非嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(6):535-536.

[4]朱俊,盛躍穎,陳敏,等.軍團(tuán)菌毒力因子致病作用的研究進(jìn)展[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,21(11):579-580.

[5]Zhu QY,Hu ZH,Liang YM,et al.Genotyping identificationof pathogenicity island locus for Legionella pneumopgila[J].Chin J Med Technol,2007,3(1):5-12.

[6]朱慶義,胡朝暉,梁耀銘,等.嗜肺軍團(tuán)菌毒力島基因聚合酶鏈反應(yīng)分型鑒定[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,29(7):647-648.

[7]曾瑾,王玉炯,鄧光存.毒力島與細(xì)菌致病性[J].生物學(xué)雜志,2010,27(1):80-96.

[8]Samrakandi MM,Cirillo SL,Ridenour DA,et al.Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains[J].J Clin Microbiol,2002,40(4):1352-1362.

[9]De Buck E,Anné J,Lammertyn E.The role of protein secretion systems in the virulence of the intracellular pathogen Legionella pneumophila[J].Microbiology,2007,153(Pt 12):3948-3953.

[10]Urwyler S,Nyfeler Y,Ragaz C,et al．Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases[J].Traffic,2009,10(1):76-87．

[11]Newton HJ，Ang DK，van Driel IR，et al．Molecular pathogenesis of infections caused by Legionella pneumophila[J].Clin Microbiol Rev,2010,23(2):274-298．

[12]Brassinga AK,Hiltz MF,Sisson GR,et al.A 65-kilobase pathogenicity island is unique to Philadelphia-1 strains of Legionella pneumophila[J].J Bacteriol,2003,185(15):4630-4637.

[13]Hiltz MF,Sisson GR,Brassinga AK,et al.Expression of magA in Legionella pneumophila Philadelphia-1 is developmentally regulated and a marker of formation of mature intracellular forms[J].J Bacteriol,2004,186(10):3038-3045.

[14]衛(wèi)生部.公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范[S].2006.

[15]衛(wèi)生部.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).WS195-2001.軍團(tuán)菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)和處理原則[S].2001.