何穎 崔宇 孫曉紅 王超 黨瑞 吳群紅 王德才

營養(yǎng)干預(yù)對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)IDE和NEP水平的影響

何穎 崔宇 孫曉紅 王超 黨瑞 吳群紅 王德才

目的 采用復(fù)合營養(yǎng)素對阿爾茨海默?。ˋD）APP?PSN雙轉(zhuǎn)基因小鼠營養(yǎng)干預(yù)，觀察腦內(nèi)胰島素降解酶（IDE）和腦啡肽酶（NEP）水平的差異，探討營養(yǎng)干預(yù)對AD預(yù)防和緩解的作用機(jī)制。 方法 將72只2月齡APP?PSN雙轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)分為干預(yù)組和模型組，干預(yù)組又分高、低2個(gè)劑量組；24只APP?PSN轉(zhuǎn)基因陰性小鼠作為陰性對照組。干預(yù)組飼喂添加復(fù)合營養(yǎng)素的飼料，模型組和陰性對照組飼喂基礎(chǔ)飼料。在干預(yù)7月后，免疫組織化學(xué)法染色觀察小鼠腦組織中老年斑沉積；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測各組小鼠腦組織內(nèi)IDE和NEP水平。 結(jié)果 模型組小鼠大腦皮層及海馬區(qū)有較多β淀粉樣淡黃色斑塊沉積（＋＋＋）；高、低干預(yù)組分布較少（＋）；陰性對照組無沉積（－）。小鼠腦內(nèi)IDE和NEP水平，高、低干預(yù)組與模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

結(jié)論 復(fù)合營養(yǎng)素干預(yù)能夠提高APP?PSN雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)IDE及NEP的活性及含量，減少β淀粉樣蛋白沉積，有改善AD病情，預(yù)防AD的作用。

阿爾茨海默?。灰葝u素降解酶；腦啡肽酶；β淀粉樣蛋白

阿爾茨海默?。ˋD）是一種發(fā)病率較高，以認(rèn)知功能減退為特征的神經(jīng)退行性改變的老年性疾病，發(fā)病機(jī)制未明，迄今為止尚無藥物能夠有效治療AD［1］。近年來研究認(rèn)為腦內(nèi)β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積是AD的主要病理學(xué)特征之一［2?3］，因此，控制Aβ蛋白的沉積，促進(jìn)其降解可能預(yù)防AD的發(fā)生。目前有研究表明，腦內(nèi)腦啡肽酶（NEP）和胰島素降解酶（IDE）能夠降解或減慢Aβ的產(chǎn)生及沉積［4?5］，IDE和NEP水平降低會加劇腦內(nèi)Aβ聚集，水平升高則能降低腦內(nèi)Aβ水平［6］。本研究主要通過對C57BL／6JAPP?PSN轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行復(fù)合營養(yǎng)素干預(yù)，觀察營養(yǎng)素對小鼠腦內(nèi)IDE和NEP水平影響，探討復(fù)合營養(yǎng)素在AD預(yù)防和緩解中的作用機(jī)制，為AD早期營養(yǎng)干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及基礎(chǔ)飼料 動物：2月齡C57BL／6JAPP?PSN轉(zhuǎn)基因鼠72只，雌雄各半（南京大學(xué)模式動物研究所提供），許可證號：SCXK（蘇）2010?0001?；A(chǔ)飼料：玉米淀粉，麥芽糖糊精，粉狀纖維素，酪蛋白，蔗糖，豆油，L?半胱氨酸（北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司）。

1.2 儀器及試劑 儀器：SUNRISE酶標(biāo)儀（Unters?bergstr，奧地利），OLYMPUS顯微鏡（日本）。試劑：小鼠胰島素降解酶ELISA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠腦啡肽ELISA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠Aβ1?42抗體（香港，Abcam公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.01 mol／L；Tris緩沖液（TBS）：0.05 mol／L Tris?HCL。營養(yǎng)素：維生素E，維生素B6，維生素B12，葉黃素，葉酸，磷脂酰絲氨酸，鋅，硒，二十二碳六烯酸（DHA），二十碳五烯酸（EPA，北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司），藍(lán)莓花青素（大興安嶺林格貝有機(jī)食品有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將APP?PSN雙轉(zhuǎn)基因小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為干預(yù)組和模型組，其中高干預(yù)組（HG）、低干預(yù)組（LG）各24只，模型組（MG）24只，雌雄各半；陰性對照組（NG）為同窩轉(zhuǎn)基因陰性鼠24只。高干預(yù)組、低干預(yù)組、模型組和陰性對照組小鼠體質(zhì)量和出生日期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。干預(yù)組飼喂自制添加復(fù)合營養(yǎng)素的飼料，模型組和陰性對照組飼喂符合美國AIN?93標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)飼料。動物在SPF級動物房內(nèi)單籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度20℃～22℃，照明明暗各12 h，每周固定時(shí)間稱重，自由飲食和飲水。

1.3.2 營養(yǎng)素選擇及干預(yù)：以中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量為基礎(chǔ)，結(jié)合人群和動物營養(yǎng)干預(yù)相關(guān)的各類權(quán)威資料數(shù)據(jù)分析，制定復(fù)合營養(yǎng)素干預(yù)配方。選擇2種微量元素（鋅、硒），4種維生素（維生素B6、維生素B12、維生素E、葉酸），另外選擇葉黃素、DHA＋EPA、磷脂酰絲氨酸、藍(lán)莓花青素等10種營養(yǎng)素，并添加至基礎(chǔ)飼料，自制成復(fù)合營養(yǎng)干預(yù)飼料。干預(yù)方法：每日先給予干預(yù)飼料，再根據(jù)小鼠食量的補(bǔ)充添加基礎(chǔ)飼料。高、低干預(yù)組根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算干預(yù)劑量，每周一稱量試驗(yàn)小鼠體質(zhì)量，推算出干預(yù)飼料每日飼喂量。因小鼠每天飼料攝入量較小，故干預(yù)劑量1周為1個(gè)周期計(jì)算。模型組和陰性對照組飼喂基礎(chǔ)飼料。

干預(yù)7月后對4組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行低溫處死，無菌條件下以矢狀縫為界一半腦組織投入4%多聚甲醛溶液中固定48 h后行蠟塊包埋及切片，另一半投入液氮后迅速保存于－80℃冰箱待行NEP和IDE水平分析。

1.3.3 免疫組化染色：腦組織石蠟病理切片采用HE（蘇木精?伊紅，Hematoxylin?Eosin）染色。用兔抗鼠抗Aβ1?42為第一抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)法，對小鼠腦組織老年斑沉積作定位染色分析。首先在68℃烤片過夜，經(jīng)二甲苯脫蠟，依次用95%、90%、85%、80%濃度的乙醇水化；雙重蒸餾水漂洗2次，再用0.01 mol／L PBS緩沖溶液漂洗，3%過氧化氫處理10 min，除去組織中的過氧化氫酶；將切片置于檸檬酸抗原修復(fù)液中修復(fù)，2100℃高壓4 min；冷卻至室溫；用雙蒸水沖洗2次，0.01 mol／L PBS沖洗3次，加入山羊血清封閉，10 min后甩去多余血清，滴加Aβ抗體，4℃孵育過夜；次日取出用0.01 mol／L PBS漂洗3次，加入生物素?山羊抗小鼠IgG室溫孵育20 min；用0.05 mol／L Tris?HCL漂洗后，滴加鏈霉素抗生物素蛋白?過氧化氫酶室溫孵育20 min，用0.01 mol／L PBS充分漂洗3次；對照組及陰性對照組用0.01 mol／L PBS溶液代替一抗，排除二抗的非特異性染色。鏡下控制DAB顯色，約30 s，用蒸餾水沖洗2 min，終止反應(yīng)；蘇木素20 s復(fù)染，依次用80%、85%、90%乙醇脫水，蒸餾水沖洗至無色透明，中性樹膠封片。光學(xué)電子倒置顯微鏡觀察，采集圖像。

1.3.4 腦組織IDE和NEP檢測：樣品處理：將－80℃冰箱保存的小鼠腦組織取出暫解凍，按質(zhì)量體積比1∶5加入0.9%的生理鹽水置組織勻漿器中勻漿，3000 r／min離心10 min后取上清備測。按IDE和NEP固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒使用說明書進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0處理所有數(shù)據(jù)。所有計(jì)量資料均用ˉx±s表示；采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用LSD法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在整個(gè)動物實(shí)驗(yàn)過程中，高、低干預(yù)組與對照組小鼠均無死亡，毛色、進(jìn)食、精神狀況、活動能力等方面均未見異常。實(shí)驗(yàn)過程中干預(yù)組、模型組和陰性對照組小鼠攝食量和體質(zhì)量增加在各組、各時(shí)間點(diǎn)上比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4組小鼠各月齡平均體質(zhì)量比較（ˉx±s，g，n＝24）

2.2 腦組織中IDE和NEP水平 采用固相夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，對各組小鼠腦組織中IDE和NEP含量檢測。方法的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、最低檢出量IDE為：y＝1.0826x－3.1713、r＝0.9988、0～40 ng／ml、0.1 ng／ml；NEP為：y＝0.1278x－6.2901、r＝0.9909、1～1000 pg／ml、1.0 pg／ml。標(biāo)本樣品中IDE和NEP測得結(jié)果見表2。

表2 4組小鼠腦組織中IDE和NEP的含量水平（ˉx±s，n＝24）

2.3 腦病理學(xué)改變 營養(yǎng)干預(yù)7月時(shí)，小鼠腦組織做石蠟切片并進(jìn)行HE染色。模型組小鼠明顯發(fā)現(xiàn)海馬和大腦皮層神經(jīng)元減少，椎體細(xì)胞核固縮；陰性對照組未出現(xiàn)明顯病理特點(diǎn)；干預(yù)組發(fā)現(xiàn)較少的海馬和大腦皮層神經(jīng)元減少，和較少的神經(jīng)元固縮現(xiàn)象。免疫組化染色鏡檢可見模型組小鼠大腦皮層及海馬分布有較多淡黃色斑塊沉積（＋＋＋），低干預(yù)組和高干預(yù)組有較少的淡黃色沉積（＋），而陰性對照組小鼠海馬及大腦皮層沒有淡黃色沉積（－）。

3 討論

目前研究認(rèn)為Aβ纖維化后形成淀粉樣沉積是AD的特殊病理改變之一，是AD的中心環(huán)節(jié)和始動因素［7］。在AD病理改變過程中，Aβ合成和降解失衡，過多Aβ聚集形成可溶性寡聚體，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，或直接導(dǎo)致神經(jīng)元功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，IDE調(diào)節(jié)Aβ降解在AD發(fā)生和發(fā)展過程中有著非常重要的意義。IDE作為降解酶可降解Aβ，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)Aβ水平，AD患者腦內(nèi)IDE水平降低［8?9］。有效提高腦內(nèi)IDE水平可以減少Aβ單體生成，調(diào)節(jié)Aβ水平并阻止其形成淀粉樣蛋白沉積，消除其神經(jīng)毒性，延緩和改善AD病情。而NEP是Aβ分解代謝的降解酶和限速酶，其體內(nèi)水平降低亦會促進(jìn)Aβ的沉積，加速發(fā)生AD風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，NEP活性下降，且AD患者腦中NEP水平亦明顯降低［10?11］。如能有效提高NEP活性或水平，則能調(diào)節(jié)Aβ分解代謝，有效降解Aβ，減少Aβ過度沉積所致神經(jīng)損傷，可以有效地預(yù)防和緩解AD的發(fā)生及發(fā)展。

近年來，多項(xiàng)研究表明營養(yǎng)素在AD的預(yù)防和改善癥狀中有積極的作用。其中維生素E能抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基進(jìn)攻與過氧化損傷，還可通過其抗氧化作用減少Aβ蛋白的沉積和形成，使大腦免受神經(jīng)毒害；葉酸對老年人認(rèn)知損傷早期階段的短時(shí)記憶有改善作用；B族維生素干預(yù)可使血漿同型半胱氨酸水平下降，維生素B6可通過參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成代謝來影響學(xué)習(xí)記憶能力；葉黃素、多不飽和脂肪酸可以改善認(rèn)知功能；礦物質(zhì)硒、鋅是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?PX）的活性中心元素，與腦內(nèi)IDE及NEP的活性密切相關(guān)，同時(shí)可以通過GSH?PX實(shí)現(xiàn)抗氧化作用；而藍(lán)莓中的花青素具有從毛細(xì)血管滲入血液的性質(zhì)，通過抑制毛細(xì)血管的通透性，達(dá)到強(qiáng)化毛細(xì)血管，防止腦內(nèi)毛細(xì)血管損傷功能，從而延緩腦神經(jīng)衰老，促進(jìn)IDE和NEP活性提高。

本研究通過APP?PSN雙轉(zhuǎn)基因小鼠為動物模型，進(jìn)行給予營養(yǎng)素干預(yù)，觀察AD小鼠腦內(nèi)IDE和NEP水平的影響。結(jié)果顯示營養(yǎng)干預(yù)7月AD小鼠腦內(nèi)IDE和NEP水平發(fā)生明顯變化，高、低干預(yù)組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；而高、低干預(yù)組與陰性對照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。小鼠腦組織石蠟切塊做免疫組化染色，模型組小鼠大腦皮層及海馬分布有較多淡黃色斑塊沉積，高、低干預(yù)組分布有較少的淡黃色沉積，而陰性對照組小鼠海馬及大腦皮層無淡黃色沉積。提示對APP?PSN雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行營養(yǎng)素的干預(yù)能夠提高其腦內(nèi)IDE及NEP的活性及含量，減少Aβ淀粉樣蛋白產(chǎn)生，可能有助于AD的預(yù)防和改善AD病情。

在AD隨老齡化快速發(fā)展而增長，并且沒有特效藥物治療的今天，通過營養(yǎng)干預(yù)改善老年認(rèn)知功能，預(yù)防AD和延緩老年腦神經(jīng)退行性改變具有現(xiàn)實(shí)意義，且非常必要。本研究結(jié)果顯示采用礦物質(zhì)、維生素、脂肪酸及抗氧化物質(zhì)等營養(yǎng)素，既有獨(dú)特的功能又有協(xié)同效應(yīng)，通過多種途徑、針對多種目標(biāo)防止老年認(rèn)知功能減退，以及增強(qiáng)神經(jīng)退行性神經(jīng)的修復(fù)，使腦內(nèi)Aβ降解酶IDE和NEP活性升高，表達(dá)增強(qiáng)，降解和清除Aβ沉積，防止淀粉樣斑塊的形成，有效預(yù)防AD以及改善和延緩AD病情。營養(yǎng)素干預(yù)有望在AD的發(fā)病機(jī)制研究，以及預(yù)防和延緩AD發(fā)生發(fā)展中起到不可忽視的重要作用。

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Effects of nutritional intervention on IDE and NEP levels in the brain of the transgenic mice with Alzheimer's disease

HE Ying，DANG Rui，WANG De?cai．
Department of Nutrition and Food Hygiene，Public Health College；CUI Yu，WU Qun?hong．Department of Social Medicine，Public Health College，Harbin Medical University，Harbin 150081，China；SUN Xiao?hong．The First Harbin City Social Welfare Institute，Harbin 150081，China；WANG Chao．Department of Nutri?tion，Yanzhou People's Hospital，Jining 272100，China

Objective To investigate the effects of nutritional intervention on brain insulin degrading enzyme（IDE）and neprilysin（NEP）levels in APP?PSN transgenic mice with Alzheimer's disease（AD），and to study the mechanism of combined nutrients on prevention and remission for AD. Methods Seventy?two APP?PSN transgenic mice aged two months were randomly divided into the intervention group supplied with compound recipe in the diet and the model group fed with basic feed，and the intervention group were divided into high?and low?dose group.Another 24 APP?PSN transgenic negative mice were selected as negative control group.After intervention for 7 months，immunohistochemistry staining was used to evaluate the pathology in brain，and the levels of IDE and NEP in mice brain were detected by ELISA. Results By immunohistochemical staining with antibody against beta Amyloid1?42（Aβ1?42），hippocampus and cerebral cortex in model group mice appeared more typical flaxen plaque deposition（＋＋＋），and high?and low?dose group showed less pale yellow plaque deposition（＋），and plaque deposits was not found in negative control group（－）.Compared with model group，the levels of IDE and NEP in high?and low?dose groups showed significant difference（P＜0.05）. Conclusions Compound nutrition intervention may improve AD，through improving the activity and levels of IDE and NEP in APP?PSN double transgenic mice and delaying the deposition of amyloid plaques in the cerebral cortex and the hippocampus of APP?PSN mice.

Alzheimer's disease；insulin degrading enzyme；neprilysin；amyloid beta protein

R 749.16

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.03.015

2014?06?09）

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273193）

150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室（何穎，黨瑞，王德才）；衛(wèi)生管理學(xué)院（崔宇，吳群紅）；150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱市第一社會福利院（孫曉紅）；272100山東省濟(jì)寧市，濟(jì)寧市兗州區(qū)人民醫(yī)院營養(yǎng)科（王超）

王德才，Email：decaiwang＠live.cn