王建美陳菲盛柳青葉其蓁

1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，浙江金華321000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江溫州325000

甲潑尼松龍對(duì)多索茶堿在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

王建美1陳菲1盛柳青1葉其蓁2

1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，浙江金華321000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江溫州325000

目的考察單次尾靜脈注射甲潑尼松龍對(duì)大鼠體內(nèi)多索茶堿藥動(dòng)學(xué)的影響。方法將12只雄性大鼠隨機(jī)分成多索茶堿組及合并用藥組，用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定大鼠給藥前后不同時(shí)間點(diǎn)多索茶堿的血清濃度，通過(guò)PK Solver 2.0軟件擬合計(jì)算，對(duì)兩組大鼠的多索茶堿主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果兩組大鼠多索茶堿AUC0～t、AUC0～∞、t1/2比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），合并用藥組較單獨(dú)用藥組均增加；而Cl_obs合并用藥組較多索茶堿組減少。結(jié)論甲潑尼松龍可能對(duì)多索茶堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)有影響，會(huì)減慢其體內(nèi)的代謝和消除。

甲潑尼松龍；多索茶堿；藥動(dòng)學(xué)；反相高效液相色譜法

多索茶堿是具有抗炎平喘作用的新一代甲基黃嘌呤的衍生物，通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)的磷酸二酯酶達(dá)到擴(kuò)張支氣管、松弛平滑肌的作用，本品與茶堿和氨茶堿比較，具有療效強(qiáng)、毒性較低的特點(diǎn)，臨床上廣泛用于治療支氣管哮喘、支氣管炎、間質(zhì)性肺炎等慢性阻塞性肺疾病[1-4]。糖皮質(zhì)激素具有抗炎、抗過(guò)敏、抗休克、抗毒等藥理作用，甲潑尼松龍作為人工合成的中效糖皮質(zhì)激素，有較強(qiáng)的抗炎活性，并有較高的肺部濃度，能減輕慢性阻塞性肺疾病患者的急性炎癥和氣道阻塞。有文獻(xiàn)報(bào)道，臨床上聯(lián)合使用兩者能有效控制各種慢性阻塞性肺疾病的癥狀[5-7]。聯(lián)合用藥所致藥動(dòng)學(xué)變化的研究已成為合理用藥的一個(gè)重要領(lǐng)域，多索茶堿是茶堿類(lèi)藥物，治療窗比較窄，且影響其代謝的因素及藥物較多，如張文穎等[8]研究了大鼠體內(nèi)阿魏酸鈉對(duì)多索茶堿的藥動(dòng)學(xué)影響，但關(guān)于甲潑尼松龍對(duì)多索茶堿藥動(dòng)學(xué)影響問(wèn)題未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)建立了一種同時(shí)測(cè)定甲潑尼松龍和多索茶堿濃度的反相高效液相色譜法，研究多索茶堿及其與甲潑尼松龍聯(lián)用時(shí)大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為進(jìn)一步研究甲潑尼松龍?jiān)谌梭w內(nèi)對(duì)多索茶堿的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

2487型HPLC儀（美國(guó)Waters公司，包括Breeze色譜工作站，2487紫外檢測(cè)器，20μl自動(dòng)進(jìn)樣閥）；SB30001電子天平；1004型分析電子天平；TDL80-2型離心沉淀器；WH-90A微型旋渦混合器；多索茶堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100625-201202）；甲潑尼松龍對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100828-200501）；氫化可的松對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100152-200206）；注射用多索茶堿（開(kāi)封康諾藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.3 g，批號(hào)：D142823）；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（Pfizer Manufacturing Belgium NV，規(guī)格40 mg，批號(hào)：A06793）；甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

健康雄性SD大鼠12只，清潔級(jí)，體重300～320 g，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分成多索茶堿組及甲潑尼松龍和多索茶堿聯(lián)合用藥組，每組6只。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件色譜柱為Diamonsil C18柱（150mm× 4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸緩沖溶液（含1mol/L氫氧化鈉，pH 3.8）（28∶72），檢測(cè)波長(zhǎng)為263 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μl，流速為1.0 ml/min，內(nèi)標(biāo)物為氫化可的松。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)氫化可的松10mg，加甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，使成1.0 mg/m l的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密稱(chēng)取多索茶堿25 mg，用甲醇溶解并定容至25 ml容量瓶，使成1.0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。放置于4℃冰箱中備用。

取多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置于加有定量?jī)?nèi)標(biāo)氫化可的松和大鼠血清0.5 ml的離心管中，用甲醇配成濃度分別為50、25、12、6、3、1.5、0.8、0.4μg/ml的含藥血清，渦旋混合1min，10 000 r/min離心10 min，靜置20min，取上清液過(guò)濾，進(jìn)樣20μl[9]。

1.3.3 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)多索茶堿組：多索茶堿用注射用氯化鈉溶解，通過(guò)尾靜脈單劑量一次注射多索茶堿50mg/kg。給藥前取空白血，給藥后按10、30、60、90、120、180、240、300、360 min眼眶取血約0.6 ml，37℃水浴中放置2 h后，于離心機(jī)中3000 r/min低溫離心5min，吸取血清，將血清儲(chǔ)存在－20℃待測(cè)。

合并用藥組：甲潑尼松龍用自帶的稀釋液稀釋。通過(guò)尾靜脈同時(shí)給予甲潑尼松龍100 mg/kg和多索茶堿50 mg/kg，給藥后按前述時(shí)間點(diǎn)從眼眶取血約0.6ml，按前述“多索茶堿組”方法處理樣本，以測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)多索茶堿的血藥濃度。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用PK Solver 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算程序擬合，求出主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 空白血清色譜圖

圖2 空白血清+多索茶堿+內(nèi)標(biāo)氫化可的松+甲潑尼松龍色譜圖

2.1 方法的專(zhuān)屬性

按“1.3.1色譜條件”測(cè)定大鼠空白血清色譜圖見(jiàn)圖1；大鼠空白血清+多索茶堿+內(nèi)標(biāo)氫化可的松+甲潑尼松龍的色譜圖見(jiàn)圖2。多索茶堿、內(nèi)標(biāo)氫化可的松和甲潑尼松龍的保留時(shí)間分別為：3.974、12.846、21.607 min，三者峰型良好，分離完全，另外血清中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)待測(cè)物出峰也不造成干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

對(duì)“1.3.2”配制的多索茶堿溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，相關(guān)圖譜見(jiàn)圖3，以測(cè)得多索茶堿峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比Y對(duì)血清藥物濃度X（μg/ml）進(jìn)行線性回歸，重復(fù)測(cè)定5次，得多索茶堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0814X－0.0466（r=0.9997），線性范圍為0.8～50μg/ml，最低檢測(cè)濃度為0.4μg/ml。

圖3 合并用藥組給藥后30 m in色譜圖

2.3 回收率和精密度試驗(yàn)

取空白血清200μl，精密加入適量多索茶堿，制備成高中低三個(gè)濃度的多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)血清樣品（含多索茶堿分別為30、7.5、1μg/ml和20、5、0.5μg/ml），按“1.3.2”項(xiàng)下自“渦旋混合1 min”起處理后進(jìn)行分析。在1 d之內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次計(jì)算日內(nèi)精密度（用日內(nèi)RSD表示），連續(xù)測(cè)定3 d計(jì)算日間精密度（用日間RSD表示），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 多索茶堿回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.4 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

采用非房室模型對(duì)兩組大鼠的單次尾靜脈注射多索茶堿50mg/kg后血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其中峰濃度和達(dá)峰時(shí)間采用實(shí)測(cè)值，兩組的具體藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2，平均血藥濃度（n=6）的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖4。與多索茶堿組比較，合并用藥組半衰期（t1/2）、達(dá)峰濃度（Cmax）、AUC0～t、AUC0～∞上升，血漿清除率（Cl_obs）下降。兩組的t1/2、AUC0～t、AUC0～∞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 合用甲潑尼松龍前后多索茶堿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)變化

圖4 合用甲潑尼松龍前后多索茶堿平均血藥濃度的藥時(shí)曲線

3 討論

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的取血點(diǎn)是通過(guò)學(xué)習(xí)相關(guān)參考文獻(xiàn)[10-14]，并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。在血清除蛋白方法建立實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選用過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道的三氯醋酸、高氯酸作為蛋白沉淀劑，以減少血清中待測(cè)物的稀釋倍數(shù)，提高回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述方法血清內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)樣品峰干擾大，檢出面積小，降低了靈敏度，且不利于保護(hù)色譜柱。采用2倍體積的甲醇沉淀蛋白，方法簡(jiǎn)單，色譜峰峰型較好，回收率高且血清內(nèi)源性物質(zhì)不影響待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

《FDA藥物相互作用研究指南（草案）》體內(nèi)藥物相互作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提出[15]，體內(nèi)藥物藥動(dòng)學(xué)研究通常采用比較藥物濃度在有和沒(méi)有合用藥物時(shí)的變化情況。根據(jù)指南設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，單次尾靜脈注射多索茶堿組和同時(shí)注射甲潑尼松龍與多索茶堿組。比較兩組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，多索茶堿的t1/2從單用藥組的108.71min增加到175.09 min，AUC0～t從1359.22μg/（ml·min）增加到1771.86μg/（ml·min），Cmax略有上升，而Cl_obs則從3.33×10-2L/（min·kg）降低到1.95×10-2L/（min·kg）。筆者認(rèn)為多索茶堿和甲潑尼松龍?jiān)诟嗡幟复x上的相互作用可能是合并用藥組多索茶堿t1/2明顯延長(zhǎng)、AUC0～t明顯增加的原因。有研究表明，茶堿類(lèi)藥物的代謝酶主要為肝微粒體代謝酶CYP1A2[16-17]，肝藥酶P450的活性受多種因素影響，如給藥劑量、用藥方式、藥物劑型以及種族差異等因素。雖然未見(jiàn)甲潑尼松龍?bào)w內(nèi)代謝情況的報(bào)道，但有文獻(xiàn)報(bào)道[18]，大劑量皮質(zhì)激素潑尼松的穩(wěn)態(tài)血藥濃度會(huì)對(duì)肝藥酶P450產(chǎn)生抑制。本實(shí)驗(yàn)從甲潑尼松龍合并用藥組AUC0～t的明顯上升推測(cè)，甲潑尼松龍可能會(huì)對(duì)肝藥酶產(chǎn)生影響。多索茶堿的藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果差異較大，多索茶堿藥時(shí)曲線符合一室、二室模型的都有報(bào)道[19-20]，且藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異較大，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲潑尼松龍100mg劑量可能減慢多索茶堿的消除，也可能是多索茶堿在不同大鼠體內(nèi)的個(gè)體差異引起。關(guān)于甲潑尼松龍對(duì)人體內(nèi)多索茶堿藥動(dòng)學(xué)的影響需經(jīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

[1]羅莉蓉.氨茶堿與多索茶堿治療慢性阻塞性肺疾病療效對(duì)比觀察[J].臨床合理用藥雜志，2015，8（2）：75-76.

[2]Sankar J，Lodha R，Kabra SK.Doxofylline：the nextgenerationmethylxanthine[J].Indian JPediatr，2008，75（3）：251-254.

[3]譚磊.多索茶堿與氨茶堿治療支氣管哮喘臨床療效的對(duì)比觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（8）：11-12.

[4]郭春麗.甲潑尼龍琥珀酸鈉治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期98例[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，40（2）：242-243.

[5]張冠磊.甲基強(qiáng)的松龍聯(lián)合多索茶堿治療COPD急性加重期療效分析[J].現(xiàn)代診斷與治療，2013，24（6）：1306-1307.

[6]陳莉亞.多索茶堿聯(lián)合甲強(qiáng)龍治療毛細(xì)支氣管炎療效觀察[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49（27）：80-81.

[7]孫偉，曹志新.慢性阻塞性肺疾病的藥物治療進(jìn)展[J].中國(guó)臨床醫(yī)生，2013，42（2）：12-14.

[8]張文穎，徐彩虹，周虹，等.多索茶堿與阿魏酸鈉藥物動(dòng)力學(xué)相互作用研究[J].中國(guó)藥劑學(xué)雜志，2009，7（4）：318-327.

[9]翁愛(ài)彬，方劍英，鄭荔莉.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)多索茶堿和3種抗癲癇藥血藥濃度[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（6）：79-81.

[10]顧健，李玉珍.多索茶堿與莫西沙星在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的相互作用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（4）：285-289.

[11]張峻，姚勤，周瓊.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定人血漿中茶堿和多索茶堿的濃度[J].中國(guó)藥房，2010，21（42）：3974-3975.

[12]李朵璐，闞全程，劉玲.左氧氟沙星對(duì)多索茶堿在健康人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響[J].中國(guó)新藥與臨床藥學(xué)雜志，2008，27（9）：680-683.

[13]馮瑞華，李志強(qiáng)，苑振亭.西尼地平對(duì)多索茶堿在大鼠體腸內(nèi)吸收的影響[J].中國(guó)藥房，2007，10（11）：1058-1060.

[14]郭利，楊秀嶺，王淑梅，等.丁苯酞對(duì)大鼠體內(nèi)多索茶堿藥動(dòng)學(xué)的影響[J].中國(guó)藥房，2013，24（25）：2337-2339.

[15]劉治軍，傅得興，湯光.FDA藥物相互作用研究指南（草案）2006版解讀[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2008，35（1）：5-6.

[16]Stavaric B.Methylxanthines：toxicity to humans.1.Theophylline[J].JChem Toxicol，1988，26（6）：541-565.

[17]胡曼曼，胡國(guó)新，周曙華.葛根素注射液對(duì)多索茶堿在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（2）：149-151.

[18]石大偉，高曉春.甲強(qiáng)龍對(duì)環(huán)孢素A在兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)影響[A]//2011年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)臨床藥學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C].2011：128-130.

[19]闞全程，李朵璐，師秀琴.HPLC測(cè)定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶堿濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究[J].藥物分析雜志，2009，29（5）：845-848.

[20]袁雅冬，趙芳，王淑梅.左氧氟沙星對(duì)慢性阻塞性肺疾病急性加重患者的多索茶堿血藥濃度的影響研究[J].中國(guó)藥房，2012，23（34）：3206-3209.

Effect of methylprednisolone on the pharmacokinetics of doxofylline in rats

WANG Jian-mei1CHEN Fei1SHENG Liu-qing1YEQi-zhen2
1.Department of Pharmacy,School of Medicine,Jinhua College of Profession and Technology in Zhejiang Province,Jinhua 321000,China;2.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital ofWenzhou Medical University in Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China

Objective To study the effect of single dosemethylprednisolone on the pharmacokinetics of doxofylline in rats.M ethods Male ratswere randomly divided into doxophylline group and combined treatment group(doxophylline+ methylprednisolone).RP-HPLCmethod was adopted to determine the serum concentration for different time before and after administration of doxofylline.Pharmacokinetic parameterswere calculated by PK Solver 2.0 pharmacokinetics software.Pharmacokinetic parameterswere compared between two groups of rats.Results The two groups had statistical difference in ratswith AUC0～t,AUC0～∞,t1/2(P<0.05).The indexs of combined treatment group were increased than that of doxophylline group,Cl_obs group of combined treatment group was decreased compared with doxofylline group.Conclusion Methylprednisolone has influence on the pharmacokinetics of doxofylline in rats,will slow the body′smetabolism and elimination.

Methylprednisolone;Doxofylline;Pharmacokinetics;RP-HPLC

R969.1

A

1674-4721（2015）04（c）-0022-04

2015-02-28本文編輯：李亞聰）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014KYA218）