高慧莉,羅光明(第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院：.藥劑科;2.呼吸科，重慶 400038)

?

·論 著·

不同pH值條件下3種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的抗菌活性及耐藥性

高慧莉1,羅光明2△(第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院：1.藥劑科;2.呼吸科，重慶 400038)

目的 不同pH值條件下3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物對金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的耐藥性和最小抑菌濃度(MIC)。方法 在pH6.0、pH7.0和pH8.0條件下，采用肉湯稀釋法分別檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對臨床分離金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌MIC及細菌耐藥性。結(jié)果 隨著pH值的增加，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的MIC值均有不同程度的降低，并呈一定的依賴效應(yīng),其中羅紅霉素和阿奇霉素的抑菌活性強于紅霉素；體外誘導試驗表明，在所有試驗pH值條件下，MIC值均有所增加，但是隨著pH值的增加細菌的MIC值逐漸降低。結(jié)論 大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的MIC隨培養(yǎng)基pH值升高而逐漸降低，在一定pH值范圍內(nèi)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物可提高金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的抗菌作用。

大環(huán)內(nèi)酯類； 抗菌活性； 細菌耐藥性； pH值

抗菌藥物的體外活性和體內(nèi)藥代動力學對細菌生長培養(yǎng)基或人體體液的pH值敏感。生物被膜可以保護細菌抵御抗菌藥物的殺傷和逃逸宿主的免疫，同時膜內(nèi)的細菌在適宜的條件下又可以從膜內(nèi)擴散游離，引起機體的再次感染，給臨床治療帶來困難[1]。有文獻認為，大環(huán)內(nèi)酯類藥物如14-元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素及15-元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物阿奇霉素，可抑制生物被膜合成，促進抗菌藥物滲透[2]。大環(huán)內(nèi)酯類含有1個第3位可離子化的氨基糖[3-4]。因此，在酸性培養(yǎng)基中，大環(huán)內(nèi)酯分子因被離子化而降低到達細菌細胞內(nèi)的數(shù)量，從而導致抗菌藥物最小抑菌濃度(MIC)的增加[5]。與紅霉素、羅紅霉素相反，阿奇霉素含有1個二甲氨基[6]。這個第2位可離子化的基團有一個較高的pKa，增加了氨基被離子化的可能性，從而使阿奇霉素很難進入細胞。因此，阿奇霉素的活性對pH值變化特別敏感。為了進一步探討不同pH值對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的影響，本研究以金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌為試驗對象，在不同pH值條件下檢測抗菌藥物的抗菌活性和誘導細菌產(chǎn)生耐藥性。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 標準菌株 以金黃色葡萄球菌(ATCC29213)和化膿性鏈球菌(ATCC19615)作為抗菌活性測定的質(zhì)控菌。臨床菌株:分離于西南醫(yī)院臨床送檢標本金黃色葡萄球菌臨床菌株5株(Sau1～Sau5)和化膿性鏈球菌臨床菌株5株(Spy1～Spy5)。

1.1.2 抗菌藥物來源及配制 大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物紅霉素(ERY)、羅紅霉素(ROX)、阿奇霉素(AZI)購自中國食品藥品檢定研究院。根據(jù)美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)2002年版抗菌藥物藥敏試驗操作標準溶解并制備貯存液濃度為3 200 mg/L[7]。上述各藥分別經(jīng)孔徑為0.22 μm濾膜過濾，將濾液分裝于無菌小瓶中，-80 ℃保存，臨用時用液體培養(yǎng)基配成所需應(yīng)用液。

1.1.3 培養(yǎng)基 采用《中華人民共和國藥典》2005年版2部,附錄Ⅺ A抗菌藥物微生物檢定法,培養(yǎng)基用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值(pH值分別為6.0、7.0、8.0)[8]。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 藥物敏感性試驗方法參見文獻[9]，用不同pH值(6.0、7.0、8.0)的液體培養(yǎng)基稀釋藥物，各管中加入等量經(jīng)臨床分離的金黃色葡萄球菌(Sau1～Sau5)和化膿性鏈球菌接種菌液(Spy1～Spy5)以及標準菌種(濃度1×105CFU/mL)，置于37 ℃溫箱孵育。每次試驗設(shè)立陽性對照和陰性對照,每批試驗重復3次，陽性對照管呈現(xiàn)良好生長即培養(yǎng)基顏色由紅變黃，而陰性對照管無生長即顏色不變，藥物試驗管完全不能生長時的藥物最低濃度為該藥對金黃色葡萄球菌(Sau1～Sau5)和化膿性鏈球菌(Spy1～Spy5)的MIC。按照NCCLS 2000年規(guī)定的臨界濃度判定每株對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的敏感性。

1.2.2 自然產(chǎn)生耐藥性 細菌以109～1010CFU/mL接種量涂布在含有2×MIC抗菌藥物不同pH值(6.0、7.0、8.0)的瓊脂平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，觀察自然產(chǎn)生耐藥性的頻率。

1.2.3 體外誘導產(chǎn)生耐藥性 體外誘導耐藥性產(chǎn)生的測定采用連續(xù)肉湯稀釋法。采用2倍稀釋法進行抗菌藥物的稀釋，使其最終濃度范圍為0.01～1 024 mg/mL。細菌接種于含有不同濃度抗菌藥物的pH值分別為6.0、7.0、8.0的M、H肉湯中，培養(yǎng)過夜。然后將肉眼可見細菌生長的最高藥物濃度(即0.5×MIC)培養(yǎng)物以1∶20稀釋后，再次轉(zhuǎn)種到含不同濃度抗菌藥物的pH值分別為6.0、7.0、8.0的M、H肉湯中，培養(yǎng)過夜，重復此轉(zhuǎn)種步驟共7 d。完成連續(xù)轉(zhuǎn)種后，取具有最高藥物濃度的培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)在不含藥物的pH值分別為6.0、7.0、8.0的瓊脂平板上，以評估對抗菌藥物耐藥的穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 大環(huán)內(nèi)酯類藥物pH的變化對金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌MIC的影響 pH值的變化導致的大環(huán)內(nèi)酯類對金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的MIC結(jié)果如表1、2所示。結(jié)果表明，培養(yǎng)基pH值的降低導致大環(huán)內(nèi)酯類MIC升高。羅紅霉素和阿奇霉素的MIC升高超過10倍，其對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌的MIC達到了4.00～>64.00 mg/L。所有大環(huán)內(nèi)酯類在堿性pH值條件下表現(xiàn)出最大的體外抗菌活性。

表1 在不同pH值條件下大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對金黃色葡萄球菌的MIC(mg/L)

表2 在不同pH值條件下大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對化膿性鏈球菌的MIC(mg/L)

表3 在不同pH值條件下金黃色葡萄球菌自然產(chǎn)生耐藥性頻率

2.2 金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的自然耐藥頻率 金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的自然耐藥頻率如表3、4所示。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥頻率具有較強的pH依賴性。隨著pH值的增加，金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥頻率逐漸降低，在中性pH值條件下，耐藥頻率范圍大約為1.1×10-7～9.7×10-6；但是在酸性條件下所有細菌都表現(xiàn)出耐藥性。此外，與中性pH值相比，堿性培養(yǎng)基中生長的細菌其耐藥頻率降低了約10倍。

2.3 體外誘導金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥性 體外誘導金黃色葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥性如表5所示(化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥性的結(jié)果與金黃色葡萄球菌相似，結(jié)果未顯示)。金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物都表現(xiàn)出高水平的耐藥性。大環(huán)內(nèi)酯類在6 d試驗研究階段中其MIC升高了16～133倍。MIC在所有試驗pH條件下均有所增加，然而在酸性條件下MIC增加趨勢比較明顯。此外，在pH6.0時，阿奇霉素對金黃色葡萄球菌具有較高的MIC(>64.00 mg/L)。

表4 在不同pH值條件下化膿性鏈球菌自然產(chǎn)生耐藥性頻率

表5 兩種細菌在不同pH值條件下體外誘導產(chǎn)生耐藥性(mg/L)

3 討 論

本研究采用肉湯稀釋法檢測在不同pH值條件下3種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的抗菌活性。結(jié)果表明，5株金黃色葡萄球菌和5株化膿性鏈球菌對3種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥性均表現(xiàn)出pH值依賴性，隨著含有紅霉素、羅紅霉素和阿奇霉素的培養(yǎng)基pH值的增加，MCI逐漸降低。此外pH6.0升至pH8.0時，3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物對細菌的MIC范圍逐漸降低，其中羅紅霉素和阿奇霉素的MIC降低至少10倍，即大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗菌活性隨著pH的升高而增強，作者的研究結(jié)果與文獻報道相一致[9-10]。

對于呼吸道感染病原菌，大環(huán)內(nèi)酯類的MIC值隨pH值的降低而增加，堿性pH條件下MIC值最低。大環(huán)內(nèi)酯類在酸性環(huán)境中其MIC值增加了10倍。阿奇霉素在化學結(jié)構(gòu)上因第2位堿基的存在，使其比其他大環(huán)內(nèi)酯類更容易被離子化，因此阿奇霉素的MICs更易受到pH值的影響。由于pH值降低導致了MIC的顯著增加，耐藥表型也隨之增加。在酸性環(huán)境中，所有細菌顯示出耐藥表型。其可能的作用機制為在酸性pH值條件下大環(huán)內(nèi)酯類藥物抗菌活性丟失。研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物不僅可通過5位上的氨基去氧糖與A2058靶點結(jié)合，其C-11、C-12氨基甲酸酯側(cè)鏈還能與第2靶點A752結(jié)合，且結(jié)合力更強，從而發(fā)揮抗耐藥菌活性[11]。方向群和劉又寧[12]研究表明羅紅霉素能提高亞胺培南對生物被膜的滲透，從而增強其對生物被膜上銅綠假單胞菌的抑菌活性。體外誘導耐藥突變試驗表明，在pH值為6.0時所有細菌都誘導發(fā)展為中敏或耐藥菌。這一現(xiàn)象與其他學者報道的數(shù)據(jù)相一致[13-15]。此外，酸性條件下細菌對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥性具有明顯增加趨勢。本研究表明，如果酸性環(huán)境能誘導體外細菌產(chǎn)生耐藥性，那么也可能誘導呼吸道感染患者體內(nèi)細菌的耐藥性發(fā)展。因此，本研究評價酸性或堿性pH值對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌活性的影響對臨床具有重要的指導意義。

人體血液pH為7.35～7.45，體外金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌生長的最適pH值為7.8～8.0，大環(huán)內(nèi)酯類MIC最小的pH為8.0，三者差異較大。而pH值對大環(huán)內(nèi)酯類藥物抗金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌活性影響較大，所以體外藥敏試驗選擇金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌生長的最適pH值時，既要保證肺金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌生長又要盡量模仿體內(nèi)條件以檢測到藥物真實的抗菌效果，同時還要考慮藥物在體內(nèi)的抗菌活性和代謝產(chǎn)物對酸堿度的影響。故認為金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌體外藥敏試驗的液體培養(yǎng)基pH值7.5較為合適，金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌在肉湯中生長不形成渾濁，對營養(yǎng)要求苛刻，難于定量對藥敏試驗的準確性影響較大。最適pH值的確定或許可為金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌體外藥敏試驗的標準化提供了1項參考指標。

[1]劉娟娟,宋毅斐,劉健.生物被膜在臨床感染性疾病中的研究進展[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2010,20(4):598-600.

[2]王睿.細菌生物被膜的產(chǎn)生與臨床意義[J].中華醫(yī)學雜志,2004,84(22):1915-1918.

[3]Marea J,Peczuh MW.Positioning and configuration of key atoms influence the topology of [13]-macrodiolides[J].J Org Chem,2013,78(15):7414-7422.

[4]尹永芹,孔令義.樹脂糖苷-大環(huán)內(nèi)酯類化合物的結(jié)構(gòu)解析研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(3):517-520.

[5]Mallegol J,Fernandes P,Seah C,et al.Determination of in vitro activity of solithromycin at different pH and its intracellular activity tested against clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae from a laboratory collection[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(9):4322-4328.

[6]Desmond RT,Magpusao AN,Lorenc C,et al.Denovo macrolide-glycolipid macrolactone hybrids:Synthesis,structure and antibiotic activity of carbohydrate-fused macrocycles[J].Beilstein J Org Chem,2014,10(1):2215-2221.

[7]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Performancestandards for antimicrobial susceptibility testing twelfth informational supplement[S].M100-S12.Pennsylvania:NCCLS,2002：1-33.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2部)[Z].北京:化學工業(yè)出版社,2005:附錄Ⅺ,83.

[9]李中興,鄭家齊,李家宏.臨床細菌學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1986:364.

[10]龍燕,陳萬寧.不同pH值對大環(huán)內(nèi)酯類藥物抗肺炎支原體活性的影響[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2009,27(1):63-64.

[11]李贊,徐進宜,顧覺奮.酮內(nèi)酯類抗菌藥物的結(jié)構(gòu)修飾研究進展[J].今日藥學,2010,5(20):1.

[12]方向群,劉又寧.亞胺培南聯(lián)合羅紅霉素對銅綠假單胞菌生物被膜的作用[J].中國抗菌藥物雜志,2009,34(11):688-690.

[13]Batard E,Juvin ME,Jacqueline C,et al.Influence of carbon dioxide on the MIC of telithromycin for Streptococcus pneumoniae:an in vitro-in vivo study[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(1):464-466.

[14]Banche G,Roana J,Allizond V,et al.In vitro compared activity of telithromycin and azithromycin against northwest Italian isolates of Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae with different erythromycin susceptibility[J].Lett Appl Microbiol,2008,47(4):309-314.

[15]Seral C,Van Bambeke F,Tulkens PM.Quantitative analysis of gentamicin,azithromycin,telithromycin,ciprofloxacin,moxifloxacin,and oritavancin(LY333328) activities against intracellular Staphylococcus aureus in mouse J774 macrophages[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(1):2283-2292.

Effect of different pH on antibacterial activity and drug resistance of macrolide antibiotics

GAOHui-li1,LUOGuang-ming2△

(1.DepartmentofPharmacy;2.DepartmentofRespiration,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To investigate the effect of staphylococcus aureus and streptococcus pyogenes on the drug resistance and the minimal inhibition concentration (MIC) of macrolide antibiotics under the different pH value conditions.Methods The broth dilution method was used to detect the drug resistance and MIC of macrolide antibiotics to clinically isolated staphylococcus aureus and streptococcus pyogenes.Results The drug resistance and MIC of macrolide antibiotics to staphylococcus aureus and streptococcus pyogenes were decreased with enhance of pH value in certainly dose-dependent manner.In addition,the inhibition activity of roxithromycin and azithromycin were stronger than that of erythromycin.The in vitro study indicated that the MIC values were increased in all the experiment pH conditions,but the MIC values gradually were decreased with augment of pH values.Conclusion The MIC values of macrolide antibiotics are gradually decreased with augment of pH values in culture medium,and macrolide antibiotics can improve the antibacterial activity of staphylococcus aureus and streptococcus pyogenes in certain pH values condition.

macrolides; antibacterial activity; bacterial resistance; pH values

高慧莉，女，大專，藥師，主要從事臨床藥學研究?！?/p>

,E-mail:lgming@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.017

A

1672-9455(2015)18-2690-04

2015-03-25

2015-04-18)