張淑莉,李 妮,張 琪(.西安醫(yī)學院醫(yī)學技術系檢驗中心，西安 700；.陜西省核工業(yè) 47醫(yī)院,西安 70600)

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·論 著·

兔抗傷寒桿菌免疫血清在免疫學檢驗實驗教學中的應用*

張淑莉1,李 妮1,張 琪2(1.西安醫(yī)學院醫(yī)學技術系檢驗中心，西安 710021；2.陜西省核工業(yè) 417醫(yī)院,西安 710600)

目的 探討制備高效價兔抗傷寒桿菌免疫血清的方法。方法 對家兔分組，采用短程免疫法，用傷寒桿菌“O”和“H”診斷菌液作為抗原，分別小劑量連續(xù)多次接種后，收集兔免疫血清，利用玻片凝集實驗、試管凝集實驗和間接凝集實驗，測定血清中抗體的效價。結果 家兔在全程免疫后產生了高效價抗體，效價分別達到了陽性，1∶1 280、1∶640。結論 用傷寒桿菌免疫家兔，制備的免疫血清在短時間內可以獲得高效價的抗血清，適用于免疫學檢驗本科實驗教學。

傷寒桿菌； 免疫血清； 制備； 效價； 免疫學檢驗； 教學

傷寒桿菌屬沙門菌屬，為革蘭陰性桿菌，呈兩端鈍圓的短桿菌，無芽胞和莢膜，體周布滿鞭毛，傷寒桿菌的“O”、“H”抗原常用于臨床診斷和實驗室分型鑒定的抗原，“O”抗原為細菌壁脂多糖，是性質穩(wěn)定的菌體抗原，耐熱，“H”抗原屬鞭毛蛋白質，對熱不穩(wěn)定，為鞭毛抗原，可經甲醛固定，利用上述特征將制備好的“O”和“H”抗原，分別免疫健康家兔，家兔體內可產生高效價的抗“O”和抗“H”血清。隨后將這些抗血清應用于例如凝集反應、肥達反應等《臨床免疫學與檢驗》實驗教學中。動物免疫血清是一項常用的免疫學實驗技術，也是作者在醫(yī)學教學中經常要用到的試劑。但目前市場上購買到的傷寒抗血清價格昂貴，效價也不高，因此為了節(jié)約經費，使用方便，提高實驗課的教學質量，多年來本實驗室自制抗血清，以傷寒桿菌“O”和“H”作為顆粒性抗原，在短時間內制備出了高效價的免疫血清，實驗效果較為理想?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗動物 健康雄性家兔10只，體質量2～3 kg，年齡8個月，無免疫接種史，做好標志，分籠飼養(yǎng)，隨機分成2組，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[1]。

1.1.2 主要試劑 生理鹽水，SRBC，傷寒沙門菌“O”、“H”診斷菌液，用甲醛滅活的傷寒沙門菌制成，由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產，濃度為7.0×109/mL。

1.1.3 設備與器材 冰箱，離心機，恒溫水浴箱，大剪刀，止血鉗，眼科手術剪，滅菌三角燒瓶，動脈導管，載玻片，兔解剖臺，試管，吸管，接種環(huán)，2.5 mL無菌注射器，酒精燈，U型微量反應板等。

1.2 免疫抗原的制備

1.2.1 傷寒沙門菌O(H)診斷菌液 實驗時，以無菌生理鹽水作1∶10稀釋，使菌液濃度為7.0×108/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹2]。

1.2.2 2% SRBC懸液 取適量抗凝綿羊血置于離心管中，加入適量生理鹽水，每次2 000 r/min離心10 min，用吸管吸去上清液，再加入2～3倍體積的生理鹽水，用吸管反復吹打混勻，如此反復洗滌3次，除去血漿蛋白。最后1次棄上清后，取紅細胞壓積，用生理鹽水配成2×108/mL(2%)SRBC懸液，置4 ℃的冰箱備用。

1.2.3 致敏SRBC的制備 取2%SRBC懸液與等量1∶10傷寒沙門菌O(H)菌液混合，置37 ℃水浴2 h，其間應該每隔15 min搖動1次，取出后離心，棄上清液，用生理鹽水洗滌3次，最后用生理鹽水配成2%的致敏SRBC懸液。

1.3 免疫途徑和程序[3-5]選擇2～3 kg健康家兔10只，耳靜脈抽血少許分離血清，檢測有無與傷寒桿菌相關的凝集素;將家兔分成2組，分別用傷寒桿菌“O”和“H”抗原進行免疫注射，每組各5只進行免疫，2組免疫注射程序相同，具體免疫程序見表1。

表1 傷寒桿菌“O”和“H”抗原免疫家兔程序

注：-表示無數(shù)據(jù)。

1.4 試血 在末次免疫后第5天試血，用無菌注射器在家兔耳緣靜脈采血1 mL,分離血清，37 ℃溫育1 h，3 000 r/min離心20 min，吸取上清液置于F管中，初步測定采用試管凝集實驗測定抗血清效價大于1∶320時，即可收獲血清，若效價不理想，可再注射抗原，再試血，直至達到要求。

1.5 采集免疫血清[6]稱兔子體質量，以3%濃度的戊巴比妥鈉溶液，按30 mg/kg進行耳緣靜脈推注麻醉，應一邊注射一邊注意觀察兔子的眼瞼反射、瞳孔和呼吸的變化，麻醉好后將家兔仰臥位，四肢固定于兔解剖臺上，使其頭部略低，以充分暴露頸部，剃毛并消毒皮膚。沿頸部中線用手術刀切開皮膚約10 cm，分離皮下結締組織，暴露出肌層，用刀柄輕輕分離，暴露頸總動脈，選擇血管中段，遠心端用細線結扎，近心端用動脈夾夾住動脈，注意勿損傷血管，用眼科小剪刀在近心端動脈壁上剪一“v”形缺口，將事先用肝素浸泡的無菌動脈導管一端插入近心端動脈中并用絲線固定，動脈導管另一端放入滅菌三角燒瓶中，然后緩緩松開動脈夾，血液很快射入到滅菌三角燒瓶中，2.5 kg家兔可放血80～100 mL。將三角燒瓶中的血液置于37 ℃水浴箱中，并做好標志，1 h后置于冰箱4 ℃ 過夜，待血塊自然收縮后分離血清，分裝凍存，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測兔免疫血清效價

1.6.1 玻片凝集實驗 取潔凈玻片2張，用記號筆分為2個等分，在玻片的左上角分別標明“1”和“2”。于上述兩玻片的左端用滅菌的接種環(huán)各加生理鹽水1～2環(huán)，同樣右端各加1∶20傷寒沙門菌免疫血清1～2環(huán)，將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌，冷卻后取少許傷寒桿菌菌液，先置于第1號玻片左端與生理鹽水混勻，再取同種細菌加至第1號玻片右端與傷寒桿菌免疫血清混勻，輕輕搖動玻片，1～2 min后觀察結果。同樣，取大腸桿菌菌液加于第2號玻片兩端。并與1號玻片比較觀察。

1.6.2 試管凝集實驗測抗O(H)血清效價 取9支試管，依次編號并做好標志。將待測抗血清進行系列倍比稀釋后與一定濃度的免疫用細菌菌液混勻，設生理鹽水對照管，使抗原抗體充分反應，肉眼觀察每個試管的凝聚程度，以凝集出現(xiàn)“++”的最高稀釋度為血清中抗體的凝集效價。見表2。

1.6.3 間接凝集實驗 取U型微量反應孔9個，依次編號，傷寒沙門菌的多糖抗原與2%的綿羊紅細胞混勻于37 ℃作用下即為致敏紅細胞，將待測血清用鹽水作連續(xù)倍比稀釋，同時設生理鹽水對照組，加入致敏SRBC懸液，充分混勻后置37 ℃水浴2 h觀察結果。見表3。

表2 試管凝集操作程序

注：搖勻后置37 ℃水浴2～4 h，或室溫過夜后觀察結果。-表示無數(shù)據(jù)。

表3 間接血凝實驗操作程序

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2 結 果

2.1 玻片凝集實驗測定血清效價結果 在充足光源黑色背景上觀察，可見1號載玻片右端液面會出現(xiàn)肉眼可見大小不等的乳白色的凝集顆?；蚰瘔K,混合懸液由均勻渾濁變?yōu)槌吻逋该?，為凝集反應陽?+)，說明制備的免疫血清與傷寒菌液抗原發(fā)生特異性結合，第1號玻片的左端和第2號玻片的左、右端生理鹽水與菌液不發(fā)生凝集，反應后混合懸液仍呈均勻渾濁，沒有出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為陰性(-)結果。

2.2 試管凝集測定血清效價結果 判斷凝集實驗結果，同樣需要有良好的光源和黑色的背景，應先觀察鹽水對照管，先不振搖，管底沉淀物呈圓形、邊緣整齊，輕輕搖動試管，細菌分散呈均勻混濁，說明對照管無凝集現(xiàn)象。然后再分別觀察各實驗管的凝集情況，并與對照管相比較。根據(jù)底部凝集物和凝集顆粒的松軟度、大小、均勻度等性狀及上清液的混濁程度，凝集程度通常以“++++”“+++”“++”“+”符號記錄。傷寒沙門菌“O”抗原凝集物呈顆粒狀沉于管底，輕搖時不易散開，黏于管底，“H”抗原凝集物呈絮狀，疏松而大塊地沉于管底，輕搖易離散。本次制備的傷寒診斷抗血清試管凝集效價為1∶1 280。見表4。

2.3 間接凝集實驗測定血清效價結果 先觀察生理鹽水對照孔，紅細胞集中沉積孔底，呈一小圓點，邊緣整齊，不發(fā)生凝集為陰性。然后自第1孔開始觀察孔內液體的渾濁程度及孔底凝集塊的大小。若紅細胞凝集，則均勻分布于孔底周圍，可根據(jù)紅細胞凝集程度判斷陽性反應的強弱，以出現(xiàn)“++”凝集的最高稀釋度為血清中抗體的凝集效價。本次制備的傷寒診斷抗血清間接凝集效價為1∶640。見表5。

表4 試管凝集測定血清效價結果

注：-表示無數(shù)據(jù)。

表5 間接凝集測定血清效價結果

注：-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

3.1 本次免疫血清的制備是一連續(xù)性、綜合性、系統(tǒng)性實驗，本實驗采用傷寒桿菌“O”和“H”標準菌液直接作為抗原免疫家兔，方法操作簡單，避免了抗原制備的繁雜程序，從實驗結果分析，本次制備的傷寒診斷免疫血清試管凝集效價為1∶1 280，間接凝集效價為1∶640，本次實驗獲得的抗血清效價較高，整個實驗方案從免疫原的制備，動物的飼養(yǎng)，免疫程序的制定與實施，動物的采血，一直到抗血清的鑒定、保存。在整個實驗過程中實驗者既學習了自制抗血清的方法，又使實驗者在理論上可印證抗原刺激機體產生免疫應答的過程,對抗原、抗體等抽象的概念得以直觀理解，從實驗角度包括了動物實驗技術、抗原的制備、凝集反應等重要的免疫學技術。同時還能充分調動學習者的積極性和主動性，培養(yǎng)實驗者分析問題和解決問題的能力，增強實驗者創(chuàng)新思維、動手能力及加強實驗者的團隊協(xié)作能力[7-8]。

3.2 將適當?shù)念w粒性抗原物質(如細菌、紅細胞等)反復多次注射到動物體內，使之產生免疫應答，經過一段時間動物血清中出現(xiàn)大量特異性抗體，這種含抗體的血清稱為抗血清(或免疫血清)。免疫血清是經過抗原免疫動物的血清，含有特異性免疫球蛋白。它不僅在病原生物學、免疫學檢驗方面應用十分廣泛，而且是一種非常重要的生物制品，大量用于病原體診斷與感染性疾病的緊急預防和治療[9]。

3.3 通過本次實驗的設計及實驗過程和結果來看，在1個月內制備的兔抗傷寒免疫血清，具有免疫時間短，整個實驗過程操作簡單易行，效價高，成本低，并將收集的抗血清作為診斷試劑隨后應用于凝集反應、肥達反應等免疫學檢驗實驗教學中，實驗效果明顯,達到了實驗教學的要求，是高校免疫學檢驗教學實驗中制備免疫血清簡便、實用的方法。

[1]孫向彬.制備高效價細菌免疫血清應重視的幾個因素[J].農墾醫(yī)學，2005，27(3)：244-245.

[2]邵長玲，孔軍伶.制備免疫血清免疫法改良和效果[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2011，29(9)：111-112.

[3]陶永平.短程免疫方案制備抗血清的效價觀察[J].山西醫(yī)藥雜志，2013，42(5)：514-515.

[4]陳小挺，樊娟娟，張玲嬌，等.實驗教學中顆粒性抗原與可溶性抗原制備抗血清的方法及其應用[J].健康研究，2010，30(1)：15-17.

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[9]劉輝.臨床免疫學和免疫檢驗實驗指導[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:1.

Application of rabbit anti-Salmonella typhi immune serum in experiment teaching of immunology test*

ZHANGShu-li1,LINi1,ZHANGQi2

(1.TestingCenter,DepartmentofMedicalTechnologyofXi′anMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710021,China;2.417HospitalofShaanxiProvincialNuclearIndustry,Xi′an,Shaanxi710600,China)

Objective To investigate the preparation method of high titer rabbit anti-Salmonella typhi immune serum.Methods The rabbits were grouped.Using short-range immunization,with the typhoid bacillus “O” and “H” diagnostic liquid as antigen,after small dose and multiple respective inoculations,the rabbit immune serum was collected.The serum antibody titer was detected by using the slide agglutination test,tube agglutination test and indirect agglutination.Results The high titer antibodies in rabbits were produced after immunization and the titers reached positive 1∶1 280 and 1∶640 respectively.Conclusion The rabbit immune serum prepared by immunizing rabbits with typhoid bacillus can obtain the high titer immune serum in a short period of time,which is suitable for the experiment teaching of undergraduate immunology test.

Salmonella typhi； immune serum； preparation； titer； immunology examination； teaching

西安醫(yī)學院質量工程檢驗實驗示范中心(XYZL2010-18)。

張淑莉，女，本科，實驗師，主要從事醫(yī)學檢驗教學方面的工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.006

A

1672-9455(2015)18-2661-03

2015-03-25

2015-04-21)