岳顯可，曹 崗，吳 瑤，陳 忠，杜偉鋒*

HPLC法測(cè)定猴頭菇核苷類成分腺苷的含量

岳顯可1,2，曹 崗1，吳 瑤1，陳 忠2，杜偉鋒1*

目的 建立HPLC法測(cè)定猴頭菇中核苷類成分腺苷的含量。方法 采用HPLC法，分別對(duì)系統(tǒng)適用性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性范圍、耐用性進(jìn)行研究；分別考察樣品制備的提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間和料液比。結(jié)果 本方法的系統(tǒng)適用性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、線性范圍、耐用性均符合要求。結(jié)論 本法科學(xué)合理、準(zhǔn)確可靠，可作為猴頭菇藥材中腺苷含量測(cè)定的分析方法。

猴頭菇；腺苷；HPLC

0 引言

猴頭菇又名猴頭菌、刺猬菌、山伏菌或花菜菌等，性平味甘，入胃經(jīng)，有助于消化，利五臟，扶正固本，具有健腦提神的功效[1]。猴頭菇含多糖、多肽類、氨基酸等物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)胃腸道等作用。臨床上常用于治療胃潰瘍與十二指腸潰瘍等消化道疾病，療效良好[2-3]。腺苷作為一種重要的核苷類成分，具有防止心律失常、改善心腦血液循環(huán)、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放等藥理作用[4-5]。猴頭菇中含有較大含量的腺苷[2]，后者為猴頭菇的重要物質(zhì)組成部分，因此，以腺苷作為指標(biāo)對(duì)猴頭菇質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate3000型高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)，KS-80中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)，R-201恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm × 4.6 mm,5.0 μm)。

1.2 試藥 猴頭菇藥材(批號(hào)：20140417)，產(chǎn)地東北，購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司。腺苷對(duì)照品(批號(hào)：110879-200202)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純，水為重蒸水，乙醇為分析純。

2 提取方法考察

2.1 溶劑的選擇 以超聲時(shí)間45 min、超聲頻率40 Hz、料液比1∶40為條件，分別以甲醇體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%進(jìn)行提取，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)猴頭菇腺苷提取量的影響。如圖1所示，甲醇體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)(水提取)，腺苷得率最高。

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)猴頭菇腺苷含量的影響

2.2 超聲時(shí)間的選擇 以水為提取溶劑、超聲頻率40 Hz、料液比1∶40為條件，分別超聲15、30、45、60、75、90 min進(jìn)行提取，考察超聲時(shí)間對(duì)猴頭菇腺苷提取量的影響。如圖2所示，不同超聲時(shí)間所得猴頭菇腺苷得率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇45 min為超聲提取時(shí)間。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)猴頭菇腺苷含量的影響

2.3 超聲頻率的選擇 以水為提取溶劑、超聲時(shí)間45 min、料液比1∶40為條件，分別超聲頻率20、30、40、50、60、70 Hz進(jìn)行提取，考察超聲頻率對(duì)猴頭菇腺苷提取量的影響。如圖3所示，不同超聲頻率下的猴頭菇腺苷得率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇40 Hz為超聲頻率。

圖3 超聲頻率對(duì)猴頭菇腺苷含量的影響

2.4 料液比的選擇 以水為提取溶劑、超聲時(shí)間45 min、超聲頻率40 Hz為條件，分別以料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80進(jìn)行提取，考察料液比對(duì)猴頭菇腺苷提取量的影響。如圖4所示，不同的料液比所得猴頭菇腺苷得率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇料液比1∶50進(jìn)行提取。

圖4 料液比對(duì)猴頭菇腺苷含量的影響

2.5 猴頭菇腺苷提取工藝的優(yōu)化

2.5.1 猴頭菇水提物穩(wěn)定性考察 對(duì)猴頭菇水提液樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在32 h內(nèi)，猴頭菇腺苷含量由0 h的1.350 mg/g降至32 h的0.071 mg/g。見(jiàn)圖5。由圖5可知，猴頭菇水提物的穩(wěn)定性差。

圖5 猴頭菇水提液腺苷穩(wěn)定性趨勢(shì)

2.5.2 猴頭菇腺苷轉(zhuǎn)移率考察 取猴頭菇水提物濾液5 mL，蒸干，加甲醇溶解，于5 mL容量瓶定容。對(duì)水提液中的腺苷含量與轉(zhuǎn)移后的腺苷含量進(jìn)行比較，并計(jì)算轉(zhuǎn)移率，見(jiàn)表1。由表1可知，先水提，蒸干，再以甲醇溶解，腺苷含量的平均轉(zhuǎn)移率為99.97%。

表1 猴頭菇腺苷轉(zhuǎn)移率

2.5.3 優(yōu)化后猴頭菇供試品的穩(wěn)定性 轉(zhuǎn)移后，樣品溶劑為甲醇，比較30 h內(nèi)猴頭菇腺苷的變化情況，結(jié)果RSD=1.14%，見(jiàn)表2。

表2 猴頭菇供試品穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.6 提取方法的確定 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，確定猴頭菇腺苷的提取方法：以水為提取溶劑，在超聲頻率為40 Hz、料液比為1∶50下超聲45 min，取濾液5 mL，蒸干，加甲醇溶解，于5 mL容量瓶定容，供試液過(guò)膜凈化，取相應(yīng)量進(jìn)樣，檢測(cè)。

3 色譜條件的考察

3.1 波長(zhǎng)的選擇 取適量腺苷標(biāo)準(zhǔn)品1.62 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，再精密吸取1 mL于20 mL容量瓶中，加甲醇定容，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。取對(duì)照品溶液，置紫外分光光度計(jì)下記錄其紫外吸收光譜，結(jié)果顯示，腺苷在260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇260 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)。甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～10 min，1%～5%A；10～15 min，5%～15% A；15～20 min，15%～20% A；20～30 min，20% A；30～35 min，20%～35% A；35～40 min，35%～1% A。柱溫25 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(A)及猴頭菇樣品(B)色譜圖

3.3 線性關(guān)系考察 以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、測(cè)定峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。并以最小二乘法計(jì)算得回歸方程：Y=0.066 5 X+0.134 6，R2=0.999 9，結(jié)果顯示，進(jìn)樣量在16.2～97.2 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 精密度考察 取供試品溶液，按以上色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為0.51%(n=6)，見(jiàn)表4。

3.5 準(zhǔn)確度考察 精密稱取已知含量的猴頭菇樣品(批號(hào)：20140417)6份，精密加入腺苷對(duì)照品適量，按上文方法提取，測(cè)得峰面積并計(jì)算含量。平均回收率為96.81%，RSD=0.33%。見(jiàn)表5。

表3 腺苷線性關(guān)系考察結(jié)果

表4 腺苷精密度考察結(jié)果

表5 腺苷回收率試驗(yàn)結(jié)果(mg/g)

4 系統(tǒng)適用性考察

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：如上述流動(dòng)相梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃。精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，分別進(jìn)樣，按不同波長(zhǎng)條件下測(cè)定，見(jiàn)表6。

表6 不同檢測(cè)波長(zhǎng)耐用性試驗(yàn)結(jié)果

4.2 柱溫考察 色譜柱、流動(dòng)相、流速同“4.1”項(xiàng)下內(nèi)容，波長(zhǎng)：260 nm。精密吸取供試品和對(duì)照品各10 μL，分別進(jìn)樣，在不同柱溫條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同柱溫耐用性試驗(yàn)結(jié)果

4.3 流速考察 色譜柱、流動(dòng)相、柱溫同“4.1”項(xiàng)下內(nèi)容，波長(zhǎng)：260 nm。精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，分別進(jìn)樣，在不同流速條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

4.4 流動(dòng)相組成比例考察 色譜柱：流速、柱溫同“4.1”，波長(zhǎng)：260 nm。精密吸取供試品和對(duì)照品各10 μL，分別進(jìn)樣，在20～30 min處對(duì)流動(dòng)相組成比例進(jìn)行變換測(cè)定，見(jiàn)表9。

表8 不同流速耐用性試驗(yàn)結(jié)果

表9 不同流動(dòng)相比例耐用性試驗(yàn)結(jié)果

4.5 樣品測(cè)定及重復(fù)性考察 精密稱取同一批號(hào)猴頭菇樣品6份，按正文方法提取，測(cè)定峰面積，并計(jì)算腺苷含量(mg/g)，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 猴頭菇供試品重復(fù)性考察結(jié)果

5 結(jié)論

5.1 提取方法的選擇 本試驗(yàn)先對(duì)提取溶劑、超聲時(shí)間、超聲頻率、料液比等單因素進(jìn)行考察，篩選以水為提取溶劑、料液比1∶50、40 Hz頻率下超聲45 min，腺苷提取率最高。然而，通過(guò)穩(wěn)定性考察，猴頭菇水提液穩(wěn)定性差，在32 h內(nèi)猴頭菇腺苷由0 h的1.350 3 mg/g降至0.071 3 mg/g。因此，本試驗(yàn)對(duì)水提液蒸干，甲醇再溶，腺苷轉(zhuǎn)移率達(dá)到99.97%，且樣品在30 h內(nèi)檢測(cè)，含量無(wú)顯著性變化，RSD為1.14%。故水提醇溶為猴頭菇腺苷的最優(yōu)提取工藝。

5.2 色譜條件的選擇 本研究對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速、流動(dòng)相等進(jìn)行耐用性考察，結(jié)果均符合要求。同時(shí)也對(duì)線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度及重復(fù)性進(jìn)行測(cè)定，最后篩選猴頭菇腺苷的最佳檢測(cè)條件為以島津Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)為色譜柱，甲醇(A)-水溶液(B)為流動(dòng)相梯度洗脫(0～10 min，1%～5%A；10～15 min，5%～15% A；15～20 min，15%～20% A；20～30 min，20% A；30～35 min，20%～35% A；35～40 min，35%～1% A)，流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

5.3 前景與展望 猴頭菇作為一種大型真菌，營(yíng)養(yǎng)豐富，是珍貴的藥膳兼用菌。在保肝護(hù)肝、健脾益胃和抗癌均有一定療效[6-7]。鑒于猴頭菇的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，目前猴頭菇膠囊、猴頭菇保健醋等已被開(kāi)發(fā)并進(jìn)入市場(chǎng)。為確保猴頭菇及相關(guān)產(chǎn)品的安全、有效，本試驗(yàn)以腺苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立猴頭菇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)猴頭菇奠定基礎(chǔ)。

[1] 周萍,李新勝,王朝川,等.常見(jiàn)的用于保健及預(yù)防疾病的食用菌種類[J].中國(guó)果蔬,2012，(6):59-60.

[2] 李潔莉,陸玲,陳坤,等.猴頭菌及其藥物制品腺苷等藥效成分分析[J].中國(guó)食用菌,2002,21(3):32-34.

[3] 周靜安.RP-HPLC測(cè)定復(fù)方猴頭顆粒制劑中腺苷的含量[J].中成藥,2005,27(2):213-214.

[4] 郝宇華,高春霖.腺苷對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用[J].醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(5):769.

[5] 臧偉進(jìn),孫蕾,于曉江.腺苷和乙酰膽堿后適應(yīng)誘導(dǎo)的心肌保護(hù)作用[J].生理學(xué)報(bào),2007,59(5):593.

[6] 仲啟祥,朱錦福,刁治民.蕈菌猴頭菇的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及開(kāi)發(fā)應(yīng)用[J].青海草業(yè),2010,(3):13-17.

[7] 王薇.猴頭菇的營(yíng)養(yǎng)保健功能及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品與藥品,2006,(4):24-26.

Determination of the nucleosides of adenosine in Hericium erinaceus by HPLC

YUE Xian-ke1,2,CAO Gang1,WU Yao1,CHEN Zhong2,DU Wei-feng1*

(1.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China; 2.Medical Pieces LTD,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 311400,China)

Objective To establish an HPLC method for determining the nucleosides of adenosine in Hericium erinaceus.Methods The suitability,accuracy,repeatability,linearity,linear range and durability were studied by HPLC.The main factors affecting sample solution were observed,including extraction method,extraction solvent,extraction time and solid-liquid ratio.Results The suitability,accuracy,repeatability,linearity,linear range durability of the method all met the relative requirements.Conclusion This method can be applied as the quantity determination of adenosine in Hericium erinaceus with good accuracy and reliability.

Hericium erinaceus; Adenosine; HPLC

2014-08-03

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，杭州 311400

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201504016