王惠 袁琳 崔秀芳 蘇菡 趙君寧 王穎 李學(xué)良

Nesfatin-1在伴或不伴幽門(mén)螺桿菌感染的相關(guān)胃病中的表達(dá)

王惠 袁琳 崔秀芳 蘇菡 趙君寧 王穎 李學(xué)良

目的 觀察Nesfatin-1在不同胃病(慢性胃炎、消化性潰瘍)中的表達(dá),尤其是在合并幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染與非感染者的胃病患者血清及胃黏膜組織中的差異。 方法 收集在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)鏡中心空腹>10 h并同時(shí)行胃鏡及13C呼氣試驗(yàn)患者共50例,采用ELISA法檢測(cè)患者血清Nesfatin-1水平,同時(shí)取胃黏膜組織行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Nesfatin-1 mRNA,免疫組化檢測(cè)Nesfatin-l/NUCB2的分布情況。 結(jié)果 Hp(-)組患者的血清及胃黏膜組織中Nesfatin-1表達(dá)明顯高于Hp (+)組患者;Hp (+)組中消化性潰瘍患者血清及胃黏膜組織中Nesfatin-1表達(dá)明顯低于非潰瘍組。 結(jié)論 Nesfatin-1表達(dá)與Hp感染相關(guān),兩者可能共同參與胃酸分泌調(diào)節(jié)。Nesfatin-1高表達(dá)可能對(duì)胃內(nèi)Hp有抑制作用,從而可能影響胃十二指腸疾病的發(fā)生。

Nesfatin-1; 幽門(mén)螺桿菌; 胃酸

Nesfatin-1在2006年10月首次發(fā)現(xiàn),是一種由82個(gè)氨基酸構(gòu)成的神經(jīng)多肽,它的前身是在下丘腦表達(dá)的核組蛋白2(nucleobindin 2,NUCB2)[1]。作為一種新發(fā)現(xiàn)的厭食肽,它在中樞和外周廣泛表達(dá)。在外周組織中,Nesfatin-1陽(yáng)性表達(dá)于十二指腸、胰島、睪丸以及胃黏膜內(nèi)分泌細(xì)胞等[2-3],其中以胃腸道細(xì)胞中Nesfatin-1表達(dá)程度最強(qiáng)。進(jìn)一步研究顯示,Nesfatin-1的作用機(jī)制與Ghrelin相反[4],可抑制胃酸分泌[5-7]。

幽門(mén)螺桿菌(Hp)是定植于胃黏膜表面與黏膜層之間的微需氧菌。Hp感染能誘發(fā)胃黏膜發(fā)生慢性炎性反應(yīng),進(jìn)而可導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍(Ulcer)和胃部惡性腫瘤等疾病。有研究顯示,胃液pH值低的胃腸疾病患者,Hp陽(yáng)性率較高;而胃液pH值高的患者,Hp陽(yáng)性率較低[8]。另外Hp感染所致的高促胃泌素血癥可能是引起高胃酸分泌的原因之一[5]。Nesfatin-1可抑制胃酸分泌,可能影響Hp在胃內(nèi)的生存,對(duì)Hp相關(guān)性胃病產(chǎn)生一定的影響,但有關(guān)Nesfatin-1與Hp的關(guān)系,國(guó)內(nèi)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道,因此本文初步觀察了慢性胃炎及Ulcer患者胃黏膜及外周血清中Nesfatin-1表達(dá)情況,特別是觀察了Hp(+)組和Hp(-)組的患者Nesfatin-1的表達(dá),以期了解Nesfatin-1與Hp對(duì)相關(guān)胃病的影響,進(jìn)一步探討二者在胃酸分泌環(huán)節(jié)如何關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例采集 選擇2014年5～6月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科門(mén)診就診的患者共50例,其中女22例,男28例,年齡范圍18～72歲,平均(47±13)歲。檢查當(dāng)天空腹≥10 h,所有患者均行胃鏡檢查并取活檢,胃鏡檢查后行13C尿素呼氣試驗(yàn),并收集患者一般資料,分為Ulcer組、慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)組、慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis,CSG)組。留取患者血清及胃黏膜活檢組織。

病例排除標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<18歲或者>80歲;(2)孕婦;(3)超重或肥胖(體質(zhì)量指數(shù)>30);(4)糖尿病;(5)惡性腫瘤;(6)近3月內(nèi)行抗Hp治療者。

1.2 患者標(biāo)本留取及相關(guān)數(shù)據(jù)采集 所有患者均簽署知情同意書(shū),采集靜脈血2 ml置于黃頭采血管,并立即4 ℃ 3000 r/min離心15 min,取上清液,于-80 ℃保存。胃鏡下活檢胃竇黏膜組織1～2塊,液氮速凍后-80 ℃保存,同時(shí)活檢胃竇黏膜組織2～3塊甲醛浸泡。記錄患者胃鏡病理結(jié)果及13C尿素呼氣試驗(yàn)DOB值(DOB值>4提示Hp陽(yáng)性,DOB值<4提示Hp陰性)。

1.3 酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)血清Nesfatin-1 將-80 ℃保存的患者血清置于4 ℃預(yù)冷的含EDTA-Na和抑肽酶的試管中,2000 r/min低溫離心15 min。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(RD,美國(guó)),檢測(cè)血清Nesfatin-1水平。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)患者胃黏膜Nesfatin-1 Nucleobindin 2抗體,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自南京力天生化試劑銷(xiāo)售中心。所有納入研究的患者胃鏡檢查時(shí)于竇大竇小處取胃黏膜2～3塊。常規(guī)固定、包埋、切片、脫蠟、脫水,檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)100 ℃熱修復(fù)20 min,3%正常羊血清封閉30 min,Nesfatin-1單克隆抗體(1∶10 000)4 ℃孵育過(guò)夜及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫下孵育30 min,DAB顯色30 s,蘇木精復(fù)染1 min,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡觀察。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用正常羊血清代替一抗。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)患者胃黏膜Nesfatin-1 mRNA表達(dá) 按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取胃黏膜組織總RNA,并依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA,按SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR,循環(huán)條件為:95 ℃15 min;95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。該實(shí)驗(yàn)中以actin mRNA作為內(nèi)參。引物序列為:HDC上游:5′-GCATGGACCACCAAGCTCTTCTAA-3′;下游:5′-CTTCCAGATCACTTGTTGCCGCTTT-3′;actin上游:5′-AAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′;下游:5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析;率的比較采用卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp在不同胃病患者中分布 不同胃病患者的Hp感染情況見(jiàn)表1。結(jié)合胃鏡報(bào)告及病理組織學(xué)檢查,CAG組、Ulcer組和CSG組患者Hp感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中Ulcer組患者的Hp感染率明顯高于CAG組和CSG組。

表1 不同胃病患者的Hp感染情況(n)

注:與Ulcer組比較,*P<0.05

2.2 Nesfatin-1在Hp(-)組與Hp(+)組患者中的表達(dá) Hp(-)組和Hp (+)組患者血清Nesfatin-1含量分別為(13.130±1.055)pg/ml、(2.552±0.664) pg/ml;胃黏膜組織中Nesfatin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.046±0.014、0.014±0.004, Hp(-)組患者血清及胃黏膜組織中Nesfatin-1表達(dá)水平均明顯高于Hp (+)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P=0.043)。見(jiàn)圖1，2。

2.3 Nesfatin-1在Ulcer組與非Ulcer組患者中的表達(dá) Ulcer組和非Ulcer組患者血清Nesfatin-1含量分別為(1.248±0.372) pg/ml和(3.550±0.552) pg/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005);胃黏膜組織Nesfatin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.010±0.003和 0.034±0.009,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。見(jiàn)圖3,4。

2.4 Nesfatin-1在Hp(-)組患者中的表達(dá) CSG組及CAG組中Hp(-)患者黏膜組織Nesfatin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.067±0.016和0.011±0.006,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.154),見(jiàn)圖5。

2.5 Nesfatin-1在Hp陰性組與陽(yáng)性組患者中的表達(dá)分布 Nesfatin-1/NUCB2免疫陽(yáng)性物質(zhì)為棕褐色顆粒,存在于細(xì)胞質(zhì),而細(xì)胞核和細(xì)胞膜均無(wú)表達(dá),用正常羊血清代替一抗的陰性對(duì)照組無(wú)表達(dá)。通過(guò)免疫組化學(xué)方法檢測(cè)患者胃黏膜組織Nesfatin-1表達(dá),結(jié)果顯示Hp(-)組胃黏膜組織Nesfatin-1陽(yáng)性表達(dá)率為53.3%,高于Hp (+)組的22.2%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)。Hp(-)組患者胃黏膜Nesfatin-1表達(dá)明顯(圖6),而Hp (+)組患者胃黏膜免疫組化切片通過(guò)放大200倍、400倍分布不明顯。

圖1 不同Hp感染情況患者血清中Nesfatin-1表達(dá)

圖2 不同Hp感染情況患者胃黏膜組織Nesfatin-1 mRNA表達(dá)

圖3 Ulcer組和非Ulcer組患者血清Nesfatin-1表達(dá)

圖4 Ulcer組和非Ulcer組患者胃黏膜組織Nesfatin-1 mRNA表達(dá)

圖5 CSG組和CAG組Hp(-)患者黏膜組織Nesfatin-1 mRNA表達(dá)

注:箭頭所指為Nesfatin-1/NUCB2免疫陽(yáng)性細(xì)胞的所在部位圖6 Nesfatin-1/NUCB2在人胃黏膜中陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

眾所周知,胃酸分泌調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。外周多種激素和中樞神經(jīng)相互協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)胃酸分泌,而胃酸在胃生理功能方面起著重要作用,不同胃腸疾病胃酸分泌情況不同。有研究表明Nesfatin-1很可能通過(guò)激活迷走神經(jīng)抑制胃酸的分泌,但這個(gè)抑制過(guò)程是通過(guò)直接作用于壁細(xì)胞,還是通過(guò)間接作用于胃黏膜其他細(xì)胞,抑或通過(guò)作用于某種受體,目前尚未清楚,還需深入研究[9-10]。Hp的感染率與胃酸的分泌密切相關(guān),進(jìn)而影響某些疾病的發(fā)生。

Nesfatin-1是日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種新的厭食肽,包含82個(gè)氨基酸,起源于NMCB2。NMCB2在激素原轉(zhuǎn)化酶的作用下水解為N-端片段Nesfatin-1和2個(gè)C-端肽Nesfatin-2和Nesfatin-3。但只有Nesfatin-1能夠抑制大鼠的攝食量和體質(zhì)量的增加。Nesfatin-1表達(dá)于下丘腦弓狀核、室旁核、腦干的迷走神經(jīng)背核、孤束核以及胃、胰腺、十二指腸等外周組織中。Nesfatin-1可以調(diào)節(jié)多種生理活動(dòng),包括抑制攝食、能量調(diào)節(jié)、胃腸運(yùn)動(dòng)和胃黏膜的保護(hù)作用等[11]。研究還發(fā)現(xiàn):Nesfatin-l主要與胃泌酸腺的中間部分的X/A樣細(xì)胞分泌的Ghrelin共存,Nesfatin-1還在泌酸腺基底部的少數(shù)細(xì)胞中與生長(zhǎng)抑素和組氨酸脫羧酶共存[12],提示Nesfatin-l在胃黏膜的分泌功能中起著重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,側(cè)腦室注射N(xiāo)esfatin-1后,不僅抑制大鼠的胃酸分泌,而且減少胃黏膜中組胺合成的關(guān)鍵酶組氨酸脫羧酶(HDC)mRNA及蛋白的表達(dá)量,從而導(dǎo)致胃體黏膜中組胺的含量降低,達(dá)到抑制胃酸和胃蛋白酶的作用[13]。而研究表明隨著胃液pH的升高,Hp陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì),這可能與胃內(nèi)酸性環(huán)境改變抑制Hp生長(zhǎng)有關(guān)。一方面,由于胃酸分泌的減少,可允許競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌的過(guò)度生長(zhǎng),進(jìn)而導(dǎo)致Hp從其生態(tài)小鏡中去除[14];另一方面也可能與胃酸分泌下降而延長(zhǎng)Hp IgA的免疫活性有關(guān)[15]。反過(guò)來(lái)Hp感染也影響著胃酸的分泌。綜合以上,我們認(rèn)為Nesfatin-1及Hp均參與胃酸分泌的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn),不同的胃病患者其Hp感染存在著明顯的差異，Hp(+)患者血清及胃黏膜組織的Nesfatin-1水平明顯低于其Hp(-)組,Ulcer患者的血清及胃黏膜組織Nesfatin-1水平明顯低于非潰瘍患者。上述現(xiàn)象可能是由于Nesfatin-1與Hp在胃酸分泌的某些環(huán)節(jié)存在一定的拮抗作用,具體機(jī)制目前尚不明確。低Nesfatin-1水平患者胃內(nèi)pH值偏低,從而有利于Hp的感染,進(jìn)而引起相關(guān)消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生。由于本研究納入樣本量較少,以上結(jié)論有待進(jìn)一步更大樣本的研究來(lái)證實(shí),以進(jìn)一步為臨床工作提供指導(dǎo)。

[1] Oh-Ⅰ S, Shimizu H, Satoh T, et al. Identification of nesfatin-1 as a satiety molecule in the hypothalamus[J]. Nature,2006,443(7112):709-712.

[2] 張愛(ài)青,李學(xué)良,蔣春櫻,等. nesfatin-1/NUCB2在人及鼠類動(dòng)物消化系統(tǒng)的表達(dá)[J]. 中華消化雜志,2011,31(2):112-116.

[3] Zhang AQ, Li XL, Jiang CY, et al. Expression of nesfatin-1/NUCB2 in rodent digestive system[J]. World J Gastroenterol,2010,16(14):1735-1741.

[4] Kojima M,Hosoda H,Date Y,et al.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J].Nature,1999,402(6762):656-660.

[5] 葉任高,陸再英. 內(nèi)科學(xué)[M].5版.人民衛(wèi)生出版社,2001:390-400.

[6] 李靜慧,李學(xué)良,吳靜,等. Nesfatin-1對(duì)離體胃黏膜細(xì)胞胃酸分泌的影響[J]. 世界華人消化雜志,2012,20(13):1123-1130.

[7] Xia ZF, Fritze DM, Li JY, et al. Nesfatin-1 inhibits gastric acid secretion via a central vagal mechanism in rats[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2012，303(5):G570-G577.

[8] 時(shí)蘭春,王縛鯤,王仁杰,等. 胃液pH與幽門(mén)螺桿菌感染及抗-HpIgA含量的分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(3):240-242.

[9] 周晚霞,楊慧,俞紅,等.殼聚糖對(duì)大鼠胃損傷時(shí)黏膜的保護(hù)作用[J].中國(guó)生化藥物雜志,2009,30(5):326-327.

[10]張?jiān)铝?遲太升,孫玉珍,等.胃癌組織中S-100蛋白表達(dá)的臨床意義[J].中國(guó)生化藥物雜志,2012,33(5):643-645.

[11]何虹,張林,胡茂清.Nesfatin-1的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2013,2l(9):449-452.

[12]Aydin S, Dag E, Ozkan Y. Time-dependent changes in the serum levels 0f prolactin,Nesfatin-1 and ghrelin as a marker of epileptic attacks young male patients[J].Peptides,2011,32(6):1276-1280.

[13]劉錦宙,楊燕,李學(xué)良. Nesfatin-1對(duì)大鼠胃粘膜胃酸和胃蛋白酶分泌機(jī)制的研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志,2014,34(9):46-49.

[14]李麗秋,孫玉清,馬淑霞,等. 老年人萎縮性胃炎和胃癌與胃液pH及微生態(tài)環(huán)境改變的關(guān)系探討 [J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,1997,9(1):23-24.

[15]Meining A, Wick M, Miehlke S, et al. The presence of immunoglobulins in the gastric juice of patients infected with Helicobacter pylori is related to a reduced secretion of acid[J]. Helicobacter，2002，7(1):67-70.

Expression of Nesfatin-1 in patients with gastropathy complicated with or without Helicobacter pylori infection

WANGHui,CUIXiu-fang,SUHan,ZHAOJun-ning,WANGYing.DepartmentofGastroenterology,JiangsuProvinceGeriatricHospital,Nanjing210024,China;WANGHui,YUANLin,LIXue-liang.DepartemtofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicaluniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the plasma or gastricmucosa levels of Nesfatin-1 in the patients with benign gastropathy, and to elucidate the association between Helicobacter pylori(Hp) colonization and expression of Nesfatin-1 in human. Methods Fifty adult patients in Endoscopy Center of the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, who underwent both the upper gastrointestinal endoscopy and13C breath test were randomly enrolled. Blood samples were collected after a 10 hours fast before endoscopy and biopsies were endoscopically taken from the antrum. The plasma levels of Nesfatin-1 and gastric mucosa expression levels of Nesfatin-1 mRNA were detected by enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively. The distribution of Nesfatin-1 was examined with immunohistochemical (IHC) staining. Results The plasma and gastric mucosa levels of Nesfatin-1 were both significantly higher in Hp-negative patients than those in Hp-positive patients. Meanwhile, among those patients with Hp infection, the level of Nesfatin-1 was significantly lower in patients with duodenal ulcer and gastric ulcer than those without ulcers. Conclusions There may be an association between Hp infection and expression of Nesfatin-1 in human. They may jointly play an important role in the regulation of gastric acid secretion. It is suggested that high-level expression of Nesfatin-1 may partly inhibit the colonization of Hp in stomach and then involve in the pathogenesis of gastroduodenal disease.

Nesfatin-1; Helicobacter pylori; gastric acid

210029江蘇省南京市,南京醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(王惠);210024江蘇省南京市,江蘇省老年醫(yī)院消化科(王惠,崔秀芳,蘇菡，趙君寧，王穎)；210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(袁琳，李學(xué)良)

李學(xué)良,Email:ligakur@aliyun.com

R 573.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.11.018

2015-04-22)