張愛紅，鄭全輝，鄭茗予，鄭愛華

(1.河北省唐山市工人醫(yī)院ICU室 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫室， 河北唐山 063000；3.河北省唐山市第一中學(xué) 063000)

論著·基礎(chǔ)研究

p21Waf1/Cip1甲基化調(diào)控細(xì)胞衰老

張愛紅1，鄭全輝2△，鄭茗予3，鄭愛華1

(1.河北省唐山市工人醫(yī)院ICU室 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫室， 河北唐山 063000；3.河北省唐山市第一中學(xué) 063000)

目的 探討p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化改變對(duì)細(xì)胞衰老進(jìn)程的影響。方法 采用克隆、測(cè)序的方法定量檢測(cè)p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子在人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(2BS)衰老過程中的甲基化改變；RT-PCR和Western blot檢測(cè)p21Waf1/Cip1的表達(dá)；采用5-氮雜-2-脫氧胞苷去甲基化處理2BS細(xì)胞，通過MTT和β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老。結(jié)果 p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子在年輕2BS中，CpG甲基化的發(fā)生率為1.25%；在中年細(xì)胞中為27.27%；在衰老2BS細(xì)胞中為0.64%；p21Waf1/Cip1的表達(dá)在細(xì)胞衰老過程中呈波動(dòng)性變化，先增加，后降低，到細(xì)胞開始衰老時(shí)，表達(dá)又顯著增加；中年2BS細(xì)胞經(jīng)5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后，p21Waf1/Cip1表達(dá)增加，細(xì)胞增殖速率較正常中年細(xì)胞顯著降低，同時(shí)細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽性率增加。結(jié)論 p21Waf1/Cip1去甲基化加速細(xì)胞衰老。

細(xì)胞衰老；p21Waf1/Cip1；DNA甲基化；5-氮雜-2-脫氧胞苷

體外培養(yǎng)的正常人二倍體細(xì)胞在經(jīng)歷一定的細(xì)胞倍增周期之后,增殖能力下降，最后停止增殖的狀態(tài)稱為細(xì)胞衰老[1]。細(xì)胞衰老是生物整體衰老的基礎(chǔ),并且是進(jìn)化過程中形成的機(jī)體預(yù)防腫瘤發(fā)生的手段之一。目前研究表明，細(xì)胞衰老是由多種分子機(jī)制調(diào)控的主動(dòng)過程，其中，表觀遺傳學(xué)調(diào)控包括DNA甲基化，組蛋白的甲基化與乙酰化修飾以及微小RNA等均在細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮重要作用[2]。DNA甲基化是哺乳類動(dòng)物一種重要的表觀遺傳修飾方式，主要發(fā)生在CpG序列中的C堿基上。從總體上看，細(xì)胞衰老過程中DNA甲基化水平是逐漸下降的，并且其下降速度與物種壽命呈負(fù)相關(guān)[3]。然而，對(duì)于特異基因在細(xì)胞衰老過程中的甲基化改變及其對(duì)細(xì)胞衰老的影響，目前并不十分清楚。

p21Waf1/Cip1是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，通過抑制細(xì)胞周期蛋白A,細(xì)胞周期蛋白E-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2和細(xì)胞周期蛋白D-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的活性，抑制pRb蛋白的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞不能進(jìn)入S期而引起細(xì)胞增殖受阻[4]。p21Waf1/Cip1基因啟動(dòng)子富含CpG，提示其表達(dá)可能受DNA甲基化的調(diào)控。為此，本研究以人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(2BS)為研究對(duì)象，深入探討了p21Waf1/Cip1在細(xì)胞衰老過程中的甲基化改變及21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化對(duì)其表達(dá)和細(xì)胞衰老的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 2BS細(xì)胞購自北京天壇生物制品研究所；亞硫酸氫鈉、氫醌,5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-CdR)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司；β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)購自美國(guó)Invitrogen公司；RIPA蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自北京百泰克公司；鼠抗人p21Waf1/Cip1(sc-6264)一抗、β-actin一抗(sc-1616)購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京中山公司；Western blot化學(xué)發(fā)光底物購自Pierce公司；引物由上海生物工程服務(wù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 2BS細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，飽和濕度，37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到90%～95%后，進(jìn)行1∶2傳代。2BS細(xì)胞平均代齡為55～60 PDs(倍增次數(shù))，30 PDs以前為年輕細(xì)胞，30～50 PDs為中年細(xì)胞，55 PDs以后為衰老細(xì)胞[5]。

1.2.2 基因組DNA的提取 將不同代齡的2BS細(xì)胞收集于預(yù)冷的PBS中，4 ℃ 1 500 g離心收集細(xì)胞。按1×106cells/500 μL加入基因組DNA抽提緩沖液，37 ℃ 1 h,加入蛋白酶K至終濃度為100 μg/mL，50 ℃ 3 h，不時(shí)輕搖。等體積酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，于OD 260測(cè)定DNA濃度。

1.2.3 亞硫酸氫鈉處理基因組DNA 將1 μg DNA用三蒸水稀釋至50 μL，加入5 μL 3 mol/L NaOH(終濃度：0.275 mol/L),37 ℃孵育15 min。加入520 μL新鮮配制的3 mol/L亞硫酸氫鈉pH 5.0，30 μL 10 mmol/L氫醌，混勻后50 ℃孵育16 h。使用澳大利亞Qiaquick膠純化試劑盒對(duì)亞硫酸氫鈉處理過的DNA進(jìn)行純化后于-20 ℃保存。

1.2.4 甲基化特異的PCR(MSP) 用以上亞硫酸氫鈉處理過的基因組DNA作為模板，針對(duì)p21Waf1/Cip啟動(dòng)子CpG島設(shè)計(jì)引物，每條引物都包含CpG二核苷酸序列：p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化引物：上游序列為：5′-TTG TAG TAC GCG AGG TTT CG-3′,下游序列為：5′-CAA CTC AAC GCG ACC CTA AT-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為190 bp；p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子非甲基化引物：上游序列為：5′-TTT TGG GAT TGG TTG GTT TG-3′,下游序列為：5′-ACA CCC AAC TCC AAC TCC AC-3′；PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為235 bp。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共29個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色，Image Master VDS成像系統(tǒng)(Pharmacia公司)照像。

1.2.5 克隆測(cè)序 首先，用以上亞硫酸氫鈉處理過的基因組DNA作模板，分別針對(duì)p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子CpG島設(shè)計(jì)引物，使每條引物不包含CpG二核苷酸序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件同MSP。p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子上游引物序列為：5′-GGG AGG AGG GAA GTG TTT TT-3′；下游引物序列為：5′-ACA ACT ACT CAC ACC TCA ACT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠純化后與Promega公司的pGEM-T?Easy載體在4 ℃連接過夜。取2 μL連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，每一代齡2BS細(xì)胞至少挑取10個(gè)克隆，提取質(zhì)粒測(cè)序，以甲基化CpG(mCpGs)占所測(cè)總CpGs的百分含量，作為DNA甲基化的發(fā)生率。

1.2.6 RT-PCR法檢測(cè) 以澳大利亞Qiagen公司RT mini kit提取不同代齡2BS細(xì)胞總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)采用如下條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共27個(gè)循環(huán)。p21Waf1/Cip1上游序列為：5′-GAG GAA GAC CAT GTG GAC-3′；下游序列為：5′-CAG CAC TCT TAG GAA CCT C-3′；GAPDH：上游序列為：5′-CGA GTC AAC GGA TTT GGT GGT AT-3′；下游序列為：5′-AGC CTT CTC CAT GGT GAA GAC-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行密度掃描分析。

1.2.7 Western blot檢測(cè) 收集細(xì)胞，加入適量(50～300 μL)RIPA蛋白裂解液，冰上裂解20 min后離心15 min，取10 μL上清液測(cè)定蛋白含量。取等量蛋白(10 μg)進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳(125 V，30 min；160～180 V，45～60 min)。電泳至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部時(shí)結(jié)束,取出凝膠進(jìn)行濕式轉(zhuǎn)印，條件為250 mA恒流轉(zhuǎn)印60～90 min。將NC膜用TBST(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5,150 mmol/L NaCl,0.5% Tween 20)漂洗5 min。室溫用含5%低脂奶粉的TBST封閉，加入p21Waf1/Cip1一抗，濃度為1 μg/mL，4 ℃過夜。室溫下用TBST漂洗6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫下孵育1 h，TBST漂洗6次，加入底物A、B顯色5 min，曝光。Image Master VDS(Amersham Pharmarcia公司)軟件分析信號(hào)光密度。

1.2.8 DNA甲基化酶抑制劑5-aza-CdR處理 將中年(39 PD)2BS細(xì)胞接種于新培養(yǎng)瓶，密度為104cells/cm2。培養(yǎng)過夜后，加入DNA甲基化酶抑制劑5-aza-CdR，終濃度為1 μmmol/L，每24 h更換含有新鮮藥物的培養(yǎng)液，對(duì)照組細(xì)胞采用等量DMSO處理。連續(xù)處理9 d(3 PDs)后收獲細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.9 MTT法測(cè)定5-aza-CdR處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將2BS細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)2.5×103個(gè)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。分別于20、44、68、92、116、140 h和164 h加入25 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈培養(yǎng)液，每孔加200 μL DMSO，放置5～10 min后，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔的光吸收值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，平均光吸收值為縱軸，繪制生長(zhǎng)曲線，比較正常中年細(xì)胞與衰老細(xì)胞和5-aza-CdR處理中年細(xì)胞的增殖速率。

1.2.10 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色 細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%狀態(tài)時(shí)，用PBS洗2遍，室溫下以3%甲醛固定5 min，加入新鮮配置的SA-β-Gal染色液，37 ℃、無CO2條件下溫浴16 h，倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 p21Waf1/Cip1在2BS細(xì)胞衰老過程中的甲基化改變 通過DNA甲基化軟件分析，選取p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子上CpG島作為分析對(duì)象，見圖1。分別提取年輕(28 PD)、中年(42 PD)和衰老(58 PD)2BS細(xì)胞基因組DNA，經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序結(jié)果顯示，p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子在年輕細(xì)胞中，CpG甲基化的發(fā)生率為1.25%；在中年細(xì)胞中為27.27%；在衰老2BS細(xì)胞中為0.64%，見表1。

圖1 p21Waf1/Cip1基因啟動(dòng)子上CpG島所在基因位點(diǎn)

表1 p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子在2BS細(xì)胞衰老過程中的甲基化改變

2.2 p21Waf1/Cip1在2BS細(xì)胞衰老過程中的表達(dá)變化 啟動(dòng)子甲基化是抑制基因表達(dá)的一種主要的表觀遺傳學(xué)方式，為了解p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化對(duì)其表達(dá)的影響，作者采用RT-PCR和Western-blot法分別檢測(cè)連續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞開始衰老過程時(shí)p21Waf1/Cip1的表達(dá)變化。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，p21Waf1/Cip1的表達(dá)從年輕(28 PD)到中年(33 PD)2BS細(xì)胞中變化不明顯，但在中年(38～46 PD)p21Waf1/Cip1的表達(dá)顯著降低，至細(xì)胞開始衰老時(shí)(55 PD)p21Waf1/Cip1的表達(dá)又顯著增加，見圖2a。p21Waf1/Cip1在蛋白水平的表達(dá)變化與RT-PCR結(jié)果一致，表現(xiàn)為在中年2BS細(xì)胞中表達(dá)降低，而在細(xì)胞開始衰老時(shí)表達(dá)又顯著增加，見圖2b和2c。以上結(jié)果提示，p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化調(diào)控p21Waf1/Cip1在細(xì)胞衰老過程中的表達(dá)。

圖2 RT-PCR和Western blot檢測(cè)不同代齡2BS細(xì)胞中p21Waf1/Cip1的表達(dá)變化

2.3 p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子去甲基化增加p21Waf1/Cip1的表達(dá) 為進(jìn)一步驗(yàn)證p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化對(duì)其表達(dá)的影響，采用DNA甲基化酶抑制劑5-aza-CdR連續(xù)處理中年(39 PD) 2BS細(xì)胞9 d(3 PDs)，甲基化特異的PCR結(jié)果顯示，5-aza-CdR處理組2BS細(xì)胞p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化與對(duì)照處理組比較顯著降低，見圖3a和3b。但是,與對(duì)照處理組比較，5-aza-CdR處理組2BS細(xì)胞中p21Waf1/Cip1的表達(dá)顯著增加，見圖3c和3d。

圖3 DNA甲基化酶抑制劑5-aza-CdR處理中年2BS細(xì)胞p21Waf1/Cip1的甲基化和蛋白表達(dá)變化

**：P<0.01,與對(duì)照組比較。

圖45 -aza-CdR處理加速中年2BS細(xì)胞的衰老

2.4 p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子去甲基化加速細(xì)胞衰老 檢測(cè)5-aza-CdR處理對(duì)中年2BS細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組2BS細(xì)胞相比，5-aza-CdR處理組中年2BS細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著降低(P<0.01)，其增殖曲線與衰老細(xì)胞相似，顯示明顯的生長(zhǎng)阻滯，見圖4a。而且，5-aza-CdR處理中年2BS細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老表型，衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照處理組顯著增加(P<0.01)，見圖4b和4c。

3 討論

3.1 p21Waf1/Cip1參與細(xì)胞衰老調(diào)控 細(xì)胞衰老是多基因控制的細(xì)胞生理過程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖能力的逐漸喪失，細(xì)胞體積增大和衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶活性顯著增加[6]。研究證實(shí)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21Waf1/Cip1在衰老細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，并對(duì)細(xì)胞衰老過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7]。p21Waf1/Cip1能夠滅活由眾多細(xì)胞周期蛋白及其激酶組成的復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致非磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白R(shí)b表達(dá)增加并通過結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老[8-9]。

3.2 DNA甲基化調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老過程中p21Waf1/Cip1的表達(dá) 作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要方式之一，DNA甲基化主要通過以下2種機(jī)制發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。首先，甲基化的CpG序列阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互結(jié)合，目前已知的該類轉(zhuǎn)錄因子主要有E2F、NF-κβ、AP-2等；另外，甲基化的CpG與甲基化結(jié)合蛋白結(jié)合，通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，發(fā)揮直接轉(zhuǎn)錄抑制作用[10]。在此研究中，作者發(fā)現(xiàn)p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子在年輕2BS細(xì)胞中低甲基化，中年細(xì)胞中甲基化增加，而在衰老細(xì)胞中甲基化又顯著降低。與DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的抑制效果一致，p21Waf1/Cip1在2BS細(xì)胞中的表達(dá)從年輕(28 PD)到中年(46 PD)總體呈下降趨勢(shì)。但從年輕(28 PD)到中年(33 PD)階段，p21Waf1/Cip1的表達(dá)并沒有降低，而只有到38 PD時(shí)，p21Waf1/Cip1的表達(dá)才顯著降低并且一直持續(xù)到46 PD，表明p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子在中年2BS細(xì)胞中的甲基化是一個(gè)緩慢發(fā)生的過程。當(dāng)細(xì)胞開始衰老時(shí)(55 PD)，p21Waf1/Cip1的表達(dá)又明顯增加，這與p21Waf1/Cip1啟動(dòng)細(xì)胞衰老的作用是一致的。

3.3 p21Waf1/Cip1去甲基化加速細(xì)胞衰老 采用DNA甲基化酶抑制劑5-aza-CdR處理中年2BS細(xì)胞，本研究觀察到p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化程度顯著降低，表達(dá)增加，同時(shí)，與試劑對(duì)照處理組比較，5-aza-CdR處理中年2BS細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞體積增大和衰老相關(guān)β半乳糖苷酶活性的增強(qiáng)。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化調(diào)控細(xì)胞衰老的進(jìn)程。以往研究證實(shí)，細(xì)胞衰老進(jìn)程伴隨著DNA總體甲基化水平的不斷降低，而體外培養(yǎng)細(xì)胞的去甲基化處理可顯著縮短細(xì)胞的傳代次數(shù)[11]。然而，對(duì)于細(xì)胞衰老過程中DNA甲基化對(duì)特異基因的表達(dá)調(diào)控所知甚少，此研究結(jié)果表明，細(xì)胞衰老過程中DNA甲基化的改變不是一個(gè)隨機(jī)的事件，而是伴隨著細(xì)胞衰老相關(guān)p21Waf1/Cip1基因甲基化的波動(dòng)性改變，p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子去甲基化加速細(xì)胞衰老的發(fā)生。

對(duì)于細(xì)胞衰老過程中p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子甲基化的建立和維持機(jī)制目前還不清楚。有研究表明，DNA甲基化酶1(DNMT1)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，發(fā)揮對(duì)特異基因的初始甲基化作用[12]。另外，F(xiàn)atemi等[13]發(fā)現(xiàn)對(duì)于已發(fā)生少量甲基化的DNA序列，DNMT1能催化其他未甲基化的DNA迅速發(fā)生甲基化。而Brenner等[14]發(fā)現(xiàn)Myc蛋白抑制p21Waf1/Cip1的表達(dá)與Myc和DNMT3a相互作用所致p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子的異常甲基化有關(guān)。DNMT1在細(xì)胞衰老過程中表達(dá)降低，而DNMTT3a在中年細(xì)胞中表達(dá)顯著增加[15]。因此，DNMT1和(或)DNMTT3a可能參與了細(xì)胞衰老過程中p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子的甲基化調(diào)控，然而，其確切分子機(jī)制仍需大量實(shí)驗(yàn)加以證明。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞衰老過程中DNA甲基化通過調(diào)節(jié)p21Waf1/Cip1的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞衰老進(jìn)程，p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子在中年細(xì)胞中高甲基化并抑制其表達(dá)，從而發(fā)揮延緩細(xì)胞衰老的作用，而p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子去甲基化增加其表達(dá)，迅速啟動(dòng)細(xì)胞衰老的發(fā)生。該研究結(jié)果為認(rèn)識(shí)表觀遺傳學(xué)對(duì)細(xì)胞衰老的調(diào)控提供了新的線索。

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Cellular senescence is regulated by p21Waf1/Cip1methylation

ZhangAihong1，ZhengQuanhui2△,ZhengMingyu3,ZhengAihua1

(1.TangshanGongrenHospital，Tangshan，Hebei063000，China;2.HebeiUnitedUniversity,Tangshan，Hebei063000，China;3.TangshanNo.1HighSchool,Tangshan，Hebei063000，China)

Objective To explore the effect of p21Waf1/Cip1methylation changes on the process of cellular senescence.Methods Bisulfite sequencing was used to analyze the methylation changes of p21Waf1/Cip1in the process of cellular senescence;p21Waf1/Cip1expression was detected by RT-PCR and Western-blot;Middle-aged 2BS cells was treated by 5-aza-CdR and cellular senescence was detected by MTT and SA-β-Gal staining.Results Bisulfite sequencing analysis of p21Waf1/Cip1promoter showed that CpGs were methylated by 1.25% in the young 2BS cells,by 27.27% in the middle-aged 2BS cells,while only by 0.64% in the senescent cells.The expression of p21Waf1/Cip1was low in the young(28 PD) 2BS cells,it increased first(35 PD) but decreased later in the middle-aged(42 PD) cells.In the senescent 2BS cells,p21Waf1/Cip1expression was further increased.5-aza-CdR treatment resulted in decreased growth rate but increased β-Gal staining of middle-aged 2BS cells.Conclusion The process of cellular senescence is regulated by the status of p21Waf1/Cip1methylation,and p21Waf1/Cip1demethylation accelerates cellular senescence.

cellular senescence；p21Waf1/Cip1；DNA methylation；5-aza-CdR

張愛紅(1972-)，主任醫(yī)師，碩士，主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究?！?/p>

,Tel：15530864598；E-mail：zquanhui@yahoo.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.08.008

R339.3

A

1671-8348(2015)08-1035-04

2014-10-14

2014-12-19)