姚鳳云，劉 成，劉春花，王炳志

(江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004)

·實(shí)驗(yàn)研究·

《傷寒論》桂枝、甘草配伍對(duì)心陽(yáng)虛證大鼠心肌能量代謝酶活性的影響*

姚鳳云，劉 成，劉春花，王炳志

(江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004)

目的：以能量代謝相關(guān)酶為考核指標(biāo)，探討《傷寒論》桂枝、甘草配伍“辛甘化陽(yáng)”的內(nèi)涵。方法：將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和桂枝、甘草不同配伍1～8組。采用鹽酸普羅帕酮誘導(dǎo)大鼠心陽(yáng)虛證模型。動(dòng)物末次給藥后50 min，剪取相同部位心肌組織0.1 g左右，制成100 g/L的勻漿液，離心，分離上清液，檢測(cè)組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力。結(jié)果：《傷寒論》桂枝、甘草各配伍組均能提高大鼠心肌組織SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶、Na+-K+ATP酶活力，其中配伍4組的SOD、配伍5組的GPX、配伍3組的Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力與其相對(duì)應(yīng)的模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：《傷寒論》桂枝、甘草配伍辛甘化陽(yáng)配伍原理的內(nèi)涵與干預(yù)心陽(yáng)虛證大鼠心肌組織能量代謝酶有關(guān)，其作用的發(fā)揮與桂枝、甘草配伍比例及煎煮時(shí)間密切相關(guān)。

《傷寒論》；桂枝；甘草；心陽(yáng)虛證；辛甘化陽(yáng)；能量代謝；配伍原理

《傷寒論》作為一部以治療狹義傷寒證為主的經(jīng)典著作，“辛甘化陽(yáng)”思想貫穿其始末，筆者通過對(duì)《傷寒論》113方的配伍分析,將其“辛甘化陽(yáng)”法在方劑中的作用歸納為9個(gè)方面[1]，代表配伍如桂枝、甘草、干姜、甘草、附子與甘草等，其中桂枝、甘草配伍是《傷寒論》中“辛甘化陽(yáng)”出現(xiàn)頻率最高的一組，共有36首方，占方劑總數(shù)的31.86%。從滋陰和陽(yáng)的桂枝湯到調(diào)和陰陽(yáng)的小建中湯、從溫通心陽(yáng)的桂枝甘草湯到氣血陰陽(yáng)并調(diào)的炙甘草湯，無(wú)不是桂枝、甘草的配伍。因此，本課題以桂枝、甘草配伍藥組為切入點(diǎn)，采用均勻設(shè)計(jì)方法，從能量代謝酶層面，對(duì)其“辛甘化陽(yáng)”的內(nèi)涵進(jìn)行研究，旨在闡明二者配伍“辛甘化陽(yáng)”的科學(xué)本質(zhì)，為臨床應(yīng)用該配伍理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SFP級(jí)SD雄性大鼠，44～47日齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。

1.2 藥品、試劑與儀器

桂枝(批號(hào)301103871，產(chǎn)地廣西)、甘草(批號(hào)301133667，產(chǎn)地內(nèi)蒙古)，均購(gòu)自北京同仁堂(亳州)飲片有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、超微量Ca2+-Mg2+ATP酶、超微量Na+-K+ATP酶試劑盒，均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)依次為20131119，20131121，20131122，20131122。 UV1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；Tissuelyser 24型全自動(dòng)樣品快速研磨儀，上海凈信實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技部產(chǎn)品；CT14RD型低溫冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品；BT25S電子分析天平(十萬(wàn)之一)，賽多利斯科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。

1.3 桂枝、甘草配伍設(shè)計(jì)

《傷寒論》桂枝、甘草配伍，桂枝用量最大五兩(25 g)，最小六銖(1.25 g)；甘草用量最大四兩(20 g)，最小六銖(1.25 g)。采用均勻設(shè)計(jì)法，具體因素水平及均勻設(shè)計(jì)見表1～3。

表1 桂枝、甘草不同配伍因素水平表

表2 均勻設(shè)計(jì)表U8*(85)

表3 均勻設(shè)計(jì)表U8*(85)使用表

1.4 動(dòng)物分組

大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為10組，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和桂枝、甘草不同配伍1～8 組，即A1B4C7(配伍1組)、A2B8C5(配伍2組)、A3B3C3(配伍3組)、A4B7C1(配伍4組)、A5B2C8(配伍5組)、A6B6C6(配伍6組)、A7B1C4(配伍7組)和A8B5C2(配伍8組)，具體配伍劑量見均勻設(shè)計(jì)表2，每組10只。

1.5 藥物制備方法

桂枝、甘草各配伍劑量組藥物加10倍量水，浸泡30 min;按照表2設(shè)計(jì)，煎煮2次;4層紗布過濾，合并兩次濾液;濃縮至1∶1藥液(即1 g生藥/mL藥液)，放置4 ℃冰箱，備用。

1.6 慢性心陽(yáng)虛證模型的建立

采用鹽酸普羅帕酮法誘導(dǎo)，對(duì)文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行改進(jìn)，鹽酸普羅帕酮?jiǎng)┬陀勺⑸鋭└臑槠瑒?，給藥方式由腹腔注射改為灌胃給藥，具體操作如下：除正常對(duì)照組外，其他組動(dòng)物每天上午9時(shí)灌胃給予鹽酸普羅帕酮片，25 μg/g體質(zhì)量，隔日1次，持續(xù)給予8次。每次灌胃前均重新稱量體質(zhì)量，并作為該次用藥劑量的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組灌胃同體積的純凈水。

1.7 給藥方法

大鼠經(jīng)鹽酸普羅帕酮誘導(dǎo)8次后，各給藥組按表4給藥劑量于每天下午灌胃給予相應(yīng)的藥物，10 μL/g，連續(xù)30 d。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予同體積的水。給藥期間，除正常對(duì)照組外，其余各組繼續(xù)給予鹽酸普羅帕酮灌胃，每隔2日1次。每周稱量體質(zhì)量2次。

1.8 檢測(cè)指標(biāo)

各組動(dòng)物末次給藥后50 min，以氨基甲酸乙酯麻醉(1 g/kg)；仰臥固定，打開胸腔，迅速剝離心臟；生理鹽水洗凈殘留血液；剪取相同部位組織0.1 g左右，精細(xì)稱量質(zhì)量；加9倍體積預(yù)冷生理鹽水，放置于預(yù)冷的全自動(dòng)組織研磨儀內(nèi)，60Hz頻率下勻漿90 s，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 g/L的心肌組織勻漿液；4 ℃、4 500 r/min離心10 min；分離上清液，按照試劑盒說明書用紫外可見分光光度計(jì)分別于595 nm、550 nm、412 nm和636 nm檢測(cè)組織蛋白、SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力。動(dòng)物處理前禁食但不禁水14 h。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

桂枝、甘草各配伍組大鼠心肌組織SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶、Na+-K+ATP酶活力值均高于其相對(duì)應(yīng)模型對(duì)照組。其中配伍4組的SOD、配伍5組的GPX、配伍3組的Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力與其相對(duì)應(yīng)的模型對(duì)照組對(duì)比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠心肌組織SOD、GPX、 ATP酶活力對(duì)比

注：與模型對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05。

3 討 論

配伍是方劑“活的靈魂”，方劑配伍原理探究是方劑研究的核心[3]。辛甘化陽(yáng)是方劑性味配伍中五味配伍法之一，亦稱辛甘助陽(yáng)或辛甘扶陽(yáng)[4]。該配伍理論的淵源要追溯到《內(nèi)經(jīng)》時(shí)代，《素問·至真要大論》在闡述藥物性味時(shí)指出“辛甘發(fā)散為陽(yáng)”，金代醫(yī)家成無(wú)己在《注解傷寒論》中首先提出辛甘化陽(yáng)的概念。所謂辛甘化陽(yáng)，是指由辛味藥和甘味藥相合，以化生或資助陽(yáng)氣的一種配伍方法[2]。此處的陽(yáng)氣即五臟陰陽(yáng)精氣理論所指的具有溫煦、推動(dòng)、興奮等作用的氣，是人體生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是影響人體生命健康的關(guān)鍵，是生命的動(dòng)力和源泉，正如《素問·生氣通天論》所云：“陽(yáng)氣者，若天與日，失其所則折壽而不彰”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)則提出能量是生命的動(dòng)力[5]。因此，筆者將中醫(yī)“陽(yáng)氣”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“能量”聯(lián)系起來(lái)，從能量代謝相關(guān)酶層面探討《傷寒論》桂枝、甘草配伍“辛甘化陽(yáng)”原理與內(nèi)涵。

在正常的生理情況下，機(jī)體中的抗氧化防御系統(tǒng)與機(jī)體產(chǎn)生的活性氧處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)；當(dāng)機(jī)體受到外部有害因素的影響,這種平衡就可能被破壞,表現(xiàn)為活性氧過多或抗氧化劑減少,從而使活性氧堆積產(chǎn)生進(jìn)行性的脂質(zhì)過氧化并最終損傷細(xì)胞。SOD和GPX均是機(jī)體抗氧化防御體系中重要的酶, 具有清除超氧自由基,從而抑制心肌細(xì)胞膜損害，提高心肌ATP酶活力，達(dá)到間接調(diào)節(jié)心肌組織能量代謝作用[6]。ATP作為組織細(xì)胞能夠直接利用的唯一能源,其合成和分解是機(jī)體內(nèi)能量轉(zhuǎn)移和利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。ATP的分解是在ATP酶作用下進(jìn)行的。ATP酶既可影響產(chǎn)能過程,又關(guān)系到能量的轉(zhuǎn)移和利用；因此，其活性是反映機(jī)體能量代謝水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)。Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶是心肌內(nèi)能量代謝的標(biāo)志酶, 在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、收縮、代謝調(diào)節(jié)中起重要作用，其活性的降低則是細(xì)胞膜受損的標(biāo)志之一,與缺氧及氧自由基生成有關(guān)[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：《傷寒論》桂枝、甘草各配伍組均能提高鹽酸普羅帕酮所致心陽(yáng)虛證大鼠心肌組織SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶、Na+-K+ATP酶活力，其中配伍4組的SOD、配伍5組的GPX、配伍3組的Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力與其相對(duì)應(yīng)的模型對(duì)照組對(duì)比，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，筆者認(rèn)為：《傷寒論》桂枝、甘草配伍“辛甘化陽(yáng)”原理的內(nèi)涵與干預(yù)心陽(yáng)虛證大鼠心肌組織能量代謝酶有關(guān)，其作用的發(fā)揮與桂枝、甘草配伍比例及煎煮時(shí)間密切相關(guān)，當(dāng)桂枝12 g、甘草21 g、煎煮15 min，桂枝15 g、甘草6 g、煎煮50 min，桂枝9 g、甘草9 g、煎煮25 min時(shí)，對(duì)SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶、Na+-K+ATP酶活力影響最為明顯。

[1]姚鳳云，王炳志，丁舸.淺析《傷寒論》之辛甘化陽(yáng)法[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(11)：2959-2960.

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)01-0059-04

R222

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.01.31

王炳志，副教授，wbzh1123@163.com

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(81260524)；江西省自然基金資助項(xiàng)目(20122BAB205072)；江西省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(2012Z001)

2014-08-28；

2014-10-30