鐘焱 郭赟婧 夏小艷

(長沙衛(wèi)生職業(yè)學院,湖南長沙 410100)

個體化用藥基因檢測的最新進展

鐘焱 郭赟婧 夏小艷

(長沙衛(wèi)生職業(yè)學院,湖南長沙 410100)

用藥安全已成為國計民生最為關注的熱點問題之一。藥物的不良反應不僅與藥物的用量、患者的性別、年齡、體重及生理病理進程相關,也與患者的遺傳因素密切關聯(lián)?；驒z測能夠有效反應個體的遺傳因素,結合患者的實際情況,可對患者基因進行個體化診斷和治療。本文就個體化用藥基因檢測的現(xiàn)狀及發(fā)展進行闡述。

個體化用藥 基因檢測 PCR

個體化用藥就是藥物治療的“因人而已”、“私人定制”，充分考慮導致藥物差異反映的遺傳因素，對不同個體的藥物相關基因從分子水平進行檢測，臨床醫(yī)生再結合病人的病情及實際經驗，“量體裁衣”的選擇個體適應的藥物種類及劑量，提高藥物療效，提高藥物療效，降低毒副作用，減輕病人痛苦和經濟負擔，為國家節(jié)約大量藥物資源。

1 基因檢測助力個體化用藥

全球三分之一的死亡病例的致死原因不是疾病本身，而是不合理用藥。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每天開出300萬份無效或錯誤處方，中國每年因家庭用藥不良反應導致住院的人數(shù)約為250萬，而住院人數(shù)藥物不良反應發(fā)生率達10-20%，藥物不良反應死亡率為19種主要傳染病所致死亡人數(shù)的11倍，因藥物不良反應增加的醫(yī)療費用超過1000億美元。個體差異的不同會導致個體對同一藥物產生不同的不良反應，個體差異是以遺傳背景和環(huán)境因素為背景，其中遺傳因素是決定性因素。人類90%的變異是由SNP(單核苷酸多態(tài)性)引起，進而導致人類藥物代謝及反應差異。個體化用藥基因檢測可對患者基因進行個體化診斷，并在檢測結果的基礎上進行個體化治療。

1.1 基因導向性的個體化治療的優(yōu)勢

臨床藥物的適應癥和使用劑量是根據(jù)臨床試驗中多數(shù)人的結果或平均值而設定，醫(yī)生開藥方時并無法知道藥物使用者是否處于藥物的有效范圍之內。臨床傳統(tǒng)的用藥模式為疾病診斷、確定用藥方案、治療、監(jiān)控臨床反應、調整治療方案，而基因導向的個體化治療方式為疾診斷、遺傳分析、確定用藥方案、治療。這種“私人定制”的用藥模式不僅僅依靠病人病情和醫(yī)生的臨床經驗選擇藥物，還將影響臨床藥物療效的決定性因素——遺傳因素考慮其中，保證藥物的安全有效。據(jù)統(tǒng)計，憑臨床經驗治療腫瘤的療效不到30%，如治療非小細胞肺癌的藥物——吉非替尼(Gefitinib，又名易瑞沙)，它的治療效果及不良反應與患者癌細胞的EGFR基因是否發(fā)生突變緊密關聯(lián)，如肺癌患者不檢測EGFR基因突變而盲目給藥治療，患者存活期有可能會低于不治療者[1-2]。

從藥物進入人體及其整個代謝過程，很多基因的多態(tài)性都會影響藥物的代謝，如CYP2C19基因的突變就大大影響抗酸藥奧美拉唑的代謝，代謝快的患者往往藥量不夠用，而代謝慢者則相對過量產生毒性。另外有些藥物代謝過程的差異更涉及一些"前藥"，如抗凝藥——波利維(硫酸氫氯吡格雷片)，它本身是一個前藥，其代謝過程通過激活CYP2C19基因來發(fā)揮藥效。而這個基因突變則代謝不能被激活進而導致更高風險的預后不良，基因檢測可以協(xié)助臨床藥學工作者優(yōu)化藥物劑量。

1.2 個體化用藥基因檢測正在拉開全球戰(zhàn)略序幕

美國FDA已批準ROCHE、Third Wave、Nanosphere等多家公司一系列個體化用藥基因檢測產品，如：尋找吉非替尼適用人群的EFGR檢測試劑，檢測伊立替康適用人群的UGT1A1檢測試劑，指導長效抗凝血藥物華法林使用劑量的CYP2C9及VKROC1檢測試劑等，這些產品已廣泛用于臨床實踐，取得良好效果，為國家節(jié)約大量用藥資源。迄今已有100余種藥物經美國FDA批準貼上了遺傳標簽，用于提示不同基因型的患者在應用該藥物時可能產生的療效和毒性。藥物基因組學的實驗結果和臨床研究結果已經在某些領域開始轉化進入藥物實施個體化治療，尤其是多種抗腫瘤藥物應用前已在病人中開展遺傳檢測以獲得預期的療效和避免嚴重毒性反應[3-4]。

2 個體化用藥基因檢測方法及進展

個體化用藥基因檢測技術形式多樣，大多為檢測患者的各類藥物相關基因的突變，如：傳統(tǒng)的PCR-直接測序技術、PCR-焦磷酸測序技術及熒光定量PCR技術，以及新興的ARMS-PCR技術、HRM(high-resolution melting analysis)技術等。

2.1 PCR-直接測序技術

PCR-直接測序技術是將目的基因先進行PCR擴張，獲得一定量的產物后再進行測序的方法，是一種經典DNA的分析技術，在全國各大科研院校及醫(yī)院的臨床實踐應用非常廣泛。Xin Cai等采用DNA測序法檢測EGFR、KRAS和TP53基因的突變來分析這些基因突變對肺癌病人用藥的影響[5]。這種傳統(tǒng)的測序技術，耗時長、靈敏度和精度較低，結果讀取繁瑣，但其檢測成本低、高通量，能檢測已知和未知較長的序列。

2.2 PCR-焦磷酸測序技術

PCR-焦磷酸測序也是一種先必須將目的片段進行PCR擴增，再進行測序的方法。焦磷酸測序(pryosequencing，簡稱PYRO)是一種全新的酶聯(lián)級聯(lián)DNA測序技術，其原理為：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。與傳統(tǒng)的測序法相比，PYRO靈敏度和精度均較高，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點，不僅能檢測并區(qū)分所有已知序列，也能發(fā)現(xiàn)新的突變，但存在僅能準確地測定較短的序列。

該不需要對DNA樣品進行任何特殊形式的標記和染色，因其特定的優(yōu)勢，PYRO已經成為DNA分析研究的重要手段，隨著技術的不斷成熟和改進，在實踐中的應用將越來越廣泛。如Dinu D等用焦磷酸測序法檢測KRAS基因的多態(tài)性來分析其在結腸癌治療中的影響[6]。

2.3 ARMS-PCR技術

擴增阻礙突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system)，簡稱ARMS-PCR或等位基因特性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)等。其原理為：PCR擴增引物的延伸是從其3`未端開始的，而這種延伸要求引物3`端的堿基與模板序列需完全匹配，擴增才得以延續(xù)并得到預期的擴增產物，若引物3`端與模板不能配對，則引物的延伸即阻斷，不能得到相對應的 擴增產物。根據(jù)檢測位點的不同，每個突變位點分別設計兩個5`端引物，一個與正常序列互補并擴增得到正常序列的PCR產物，一個與突變序列互補而得到突變PCR產物，再根據(jù)溶解曲線的不同，就可以檢測并區(qū)分檢測位點的突變類型。該技術準確快速、簡便，且靈敏度高，能同時檢測

············兩種及兩種以上的基因的突變位點，但僅能檢測常見的已知位點，并存在假陽性問題，容易造成污染。

2.4 HRM技術

高分辨熔解曲線分析(high-resolution？melting？analysis，HRM)是興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法，其主要原理是根據(jù)DNA序列的長短、GC含量及堿基互補的差異性，采用高分辨率的溶解曲線對樣品進行分析，因其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以區(qū)分單個堿基差異。這種技術具有成本低、高通量、靈敏度高、重復性好、操作簡便等特點，它在檢測SNP位點時，無需特異性的探針和熒光標記，不受突變位點及類型的限制，已被廣泛用于個體化用藥基因檢測的科研及臨床實踐中。

3 展望

目前由于藥物基因組學知識的局限性，尚不能對每種藥物進行檢測，只能集中在迫切需要的領域。如腫瘤治療藥物的基因檢測是國內外研究和應用最多的，一方面是因為腫瘤治療觀察療效需要的時間長，依據(jù)療效調整用藥往往會貽誤治療時機；另一方面是腫瘤治療藥物有效劑量到中毒劑量間的差距小，醫(yī)學上稱之為“窗口窄”，易發(fā)生毒副作用。與常規(guī)臨床檢測不同的是，由于藥物基因組學知識尚不普及，基因檢測技術尚有一定難度，目前僅有少數(shù)醫(yī)院或專業(yè)化醫(yī)療機構有能力開展。另基因檢測質量控制、標準化方面還待進一步完善。

[1]Sreenath V.Sharma, Daphne W.Bell, Jeffrey Settleman,etc., Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer.Nature,2007,7:169-181.

[2]Yu Daping, Li Jie, Han Yi, Liu Shuku, etc., Gene expression profiles of ERCC1, TYMS, RRM1, TUBB3 and EGFR in tumor tissue from non-small cell lung cancer patients.Chinese Medical Journal,2014,127(8):1464-8.

[3]Rachel Abbots, Rosalyn Jewell, Jeremie Nsengimana, etc., Targeting human.apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) in phosphatase and tensin homolog (PTEN) deficient melanoma cells for personlized therapy.British Journal of Cancer, 2010, 102 (4)”704-9.

[4]Lei Xie, Xiaoxia Ge, Hepan Tan, etc., Towards structural systems pharmacology to study complex diseases and personalized medicine.PLoS Comput Biol, 2014,1-(5):e1033554.

[5]Xin Cai, Jiang Sheng, Chuanning Tang,etc., Frequent mutaitons in EGFR, KRAS AND TP53 gens in human lung cancer tumors detected by ion torrent DNA sequencing.Plos One, 2014,9(4): e95228.

[6]Dinu D, Dobre M, Panaitescu, etc., Prognostic significance of KRAS gene mutations in colorectal cancer- preliminary study [j].Journal of medicine and life,2014,7(4):581-7.