李 亮 彭 瓊 戴 夫

SD大鼠肝臟枯否細(xì)胞分離方法改進(jìn)研究

李 亮 彭 瓊 戴 夫

目的 研究一種簡(jiǎn)單、高效、實(shí)用并且穩(wěn)定的SD大鼠肝臟原代枯否細(xì)胞(KCs)的提取及培養(yǎng)方法。方法選擇體質(zhì)量200 g左右的健康SD雄性大鼠，采用0.05% IV型膠原酶在體原位灌注法結(jié)合剪碎法，37℃水浴振蕩20 min，經(jīng)30%和60% Percoll密度梯度離心后，再經(jīng)40% Percoll離心及貼壁法純化提取KCs。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞活力，吞墨實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞吞噬功能及流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度。結(jié)果每只大鼠平均肝臟KCs的獲得量為(1.00±0.20)×107(n=20)，細(xì)胞活力為(92.34±0.15)%，細(xì)胞純度均在(93.56±0.24)%。結(jié)論改良的SD大鼠肝臟KCs提取方法操作簡(jiǎn)單，效果可靠，可為今后KCs的研究奠定基礎(chǔ)。

枯否細(xì)胞；細(xì)胞分離；原代培養(yǎng)；細(xì)胞鑒定

枯否細(xì)胞(Kupffer cells,KCs)位于肝臟的肝血竇內(nèi)，固定于竇壁，是機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)主要組成部分,占全身單核巨噬細(xì)胞總量的80%～90%[1]，也是肝臟炎癥反應(yīng)中主要的效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)功能[2]。研究KCs的功能，對(duì)闡明KCs相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要作用，但KCs的分離培養(yǎng)比較困難，在一定程度上阻礙了對(duì)KCs相關(guān)疾病的研究[3]。KCs分離、培養(yǎng)方法的不斷改進(jìn)，可以為研究各種肝病奠定基礎(chǔ)，具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量200 g左右，購(gòu)于蘇州工業(yè)園區(qū)愛(ài)爾麥特科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(蘇)2014-0007。室溫下自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、衛(wèi)生飲水。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，6 h前禁水。

1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；Percoll細(xì)胞分離液為Pharmacia公司產(chǎn)品；臺(tái)盼藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品；APC-CD68抗體為eBioscience公司產(chǎn)品；TSl00倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品；IX51 熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；AllegraX-30R梯度離心機(jī)為Beckman Coulter公司的產(chǎn)品。1.3 細(xì)胞分離液配制 膠原酶灌注液：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.68 mmol/L、Na2HPO4·12H2O 0.7 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，Glucose 15 mmol/L，CaCl225 mmol/L、Ⅳ型膠原酶 0.1%，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL。Percoll分離液：100% Percoll分離液，9 份Percoll原液+1 份8.5% NaCl；30% Percoll分離液，3份100% Percoll分離液+7份0.85% NaCl；60% Percoll分離液,6份100% Percoll分離液+4份0.85% NaCl。1.4 實(shí)驗(yàn)操作 SD大鼠乙醚麻醉后，腹腔注射肝素1 500 U/100 g，依次消毒，開(kāi)腹，暴露出門(mén)靜脈并插管固定，打開(kāi)胸腔同時(shí)結(jié)扎下腔靜脈。緩慢灌注PBS 50 mL，速度約為10 mL/min，扎破下腔靜脈放血，反復(fù)操作3次左右，觀察肝臟顏色已變成灰黃色停止灌注PBS。37℃預(yù)熱膠原酶灌注液15 mL，緩慢灌注，約15 min后剪下肝臟并迅速剪碎，放置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中消化20 min。200目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后，將收集的肝懸液加PBS至45 mL，300 g×5 min(4℃)離心2次，去上清。所得沉淀用PBS加至45 mL，充分重懸后，50 g×3 min(4℃)離心;吸取上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL離心管中，550 g×5 min(4℃)離心，去上清。將上述肝細(xì)胞懸液緩慢移入含30%和60% Percoll分離液的離心管中，以800 g(20℃)緩升緩降離心20 min，離心后可見(jiàn)乳白色細(xì)胞層,見(jiàn)圖1。收集該細(xì)胞層細(xì)胞懸液后用40% Percoll分離液再次600 g×5 min(4℃)離心，去上清，用20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基充分吹打重懸細(xì)胞。所得細(xì)胞1×106/mL密度接種至六孔板中，置于5% CO2培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)，5～6 h后用PBS洗去未貼壁的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞鑒定 活力鑒定：細(xì)胞提取后，立即以10 μL細(xì)胞懸液和90 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)充分混勻，2～3 min后，取10 μL至計(jì)數(shù)板，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。細(xì)胞鑒定：用培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，加入經(jīng)過(guò)濾紙多次過(guò)濾并高壓滅菌過(guò)得墨汁，6 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞的吞噬能力。流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度：將提取并洗滌純化后的細(xì)胞經(jīng)CD68流式抗體染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞的純度。

2 結(jié)果

2.1 KCs數(shù)量及活力 細(xì)胞獲得量為(1.00±0.2)×107，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)(n=3)，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力為(92.34±0.15)%,見(jiàn)圖2。

2.2 細(xì)胞形態(tài) 剛獲得的細(xì)胞，形態(tài)大小基本一致，金黃色，近圓形，折光性強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)基中；繼續(xù)培養(yǎng)5～6 h，細(xì)胞貼壁良好，呈扁圓形，偶見(jiàn)梭形及多角形，金黃色；培養(yǎng)24 h后KCs開(kāi)始伸展，胞體增大，且形狀趨于不規(guī)則并有偽足伸出。培養(yǎng)7 d時(shí)，可見(jiàn)更多梭形細(xì)胞及形狀不規(guī)則細(xì)胞。見(jiàn)圖3～圖5。

2.3 吞噬功能試驗(yàn) KCs可吞噬>2 μm的顆粒，墨汁顆粒直徑約0.3 μm，本實(shí)驗(yàn)6 h后見(jiàn)較多細(xì)胞吞噬了墨汁顆粒，故提示提取的目的細(xì)胞有較強(qiáng)的吞噬能力。在培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞中加入少量碳素墨水繼續(xù)培養(yǎng)6 h，可見(jiàn)鏡下細(xì)胞99%以上均吞噬黑色碳顆粒,見(jiàn)圖6、圖7。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度 將提取并洗滌純化后的細(xì)胞經(jīng)CD68流式抗體染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞的純度,見(jiàn)圖8、圖9。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)(n=3)，提取的細(xì)胞純度均在(93.56±0.24)%。

3 討論

肝臟KCs作為體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，在全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展中起十分重要的作用[4]。目前對(duì)肝臟KCs的研究越來(lái)越多，摸索出一套高效、穩(wěn)定并且易于操作的分離、培養(yǎng)方法尤為重要。目前國(guó)內(nèi)外分離、培養(yǎng)KCs的方法比較多，有選擇性貼壁法[5]，免疫磁珠法，流式細(xì)胞術(shù)分離法[6]，密度梯度離心法等。磁珠分離法價(jià)格昂貴，有些實(shí)驗(yàn)不易操作，比如分離肝臟并保留門(mén)靜脈及下腔靜脈，離體后再插管或?qū)⒁呀?jīng)固定插管的門(mén)靜脈剝離，在實(shí)際的操作過(guò)程中，容易使插管滑落或插破血管從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，選擇性貼壁法則很難提取到高純度的KCs。諸如此類的研究報(bào)道有很多，各有差異，且存在不足之處。本研究吸收了相關(guān)研究中的精華之處，是綜合而成的一種高效、穩(wěn)定，尤其是易于操作的KCs的提取、培養(yǎng)方法。

首先，已有實(shí)驗(yàn)證明采用在體原位灌注法的效果及可行性較離體后再灌注要好[7]。本實(shí)驗(yàn)曾嘗試離體后再灌注[8]，但分離肝臟后，血管塌陷，血凝塊阻塞等問(wèn)題造成插管失敗或灌注不均勻，即使原位插管分離后灌注，也會(huì)因肝臟包膜破損而導(dǎo)致灌注失敗。本實(shí)驗(yàn)采用在體原位灌注，解決了以上問(wèn)題，且用含有雙抗的PBS液洗滌，可明顯降低污染幾率。其次，肝臟消化是整個(gè)操作環(huán)節(jié)中重要步驟，結(jié)合剪碎法，能有效縮短操作時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效果。有學(xué)者再次將獲得的肝懸液加入少許IV型膠原酶，能更好的起到消化作用[9]，IV型膠原酶原位灌注10～15 min對(duì)于肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的提取是有益的[10]。如果肝臟消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易對(duì)細(xì)胞活力及表面標(biāo)記物產(chǎn)生影響；直接剪碎法時(shí)間較長(zhǎng)，易造成消化不完全，影響KCs提取率，經(jīng)原位灌注消化后結(jié)合剪碎法可以提高KCs的提取率。因此，本實(shí)驗(yàn)IV型膠原酶灌注時(shí)間加剪碎法嚴(yán)格控制在20 min以內(nèi)。再次，由于在Percoll分離后，吸出目的細(xì)胞的過(guò)程中，不管是采用何種方法都難免會(huì)混入少量雜細(xì)胞，所以本實(shí)驗(yàn)增加了40%Percoll再次離心的實(shí)驗(yàn)步驟，除去上清后重懸培養(yǎng)即可獲得高純度的KCs。最后，鑒于KCs較其他肝臟細(xì)胞有較強(qiáng)的貼壁能力，培養(yǎng)5～10 min后即開(kāi)始貼壁，4 h后大部分KCs已牢固貼壁[11]，因此培養(yǎng)5～6 h后用PBS洗去未貼壁的細(xì)胞繼續(xù)純化，可以得到高純度的KCs。本實(shí)驗(yàn)綜合了各種操作法的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步提高了KCs的提取純度和活力。

經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)踐摸索，本實(shí)驗(yàn)有以下關(guān)鍵幾點(diǎn)：①膠原酶灌注液需在37℃溫箱中提前預(yù)熱，才能發(fā)揮酶最大效應(yīng)；②IV型膠原酶在體灌注時(shí)間要嚴(yán)格控制在10～15 min，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)過(guò)短均不利于KCs的提??；③在配置不同密度Percoll分離液和加入細(xì)胞懸液時(shí)，在滴加的過(guò)程中保持液體貼著管壁緩慢加入，避免兩層液體劇烈波動(dòng)破壞密度梯度；④實(shí)驗(yàn)過(guò)程中密度梯度離心需要控制升降速度，升降速度過(guò)快過(guò)慢均易造成密度梯度破壞，本實(shí)驗(yàn)采用升6降2的離心數(shù)值，效果滿意。此外，本實(shí)驗(yàn)主要改進(jìn)點(diǎn)有以下幾點(diǎn)：①采用0.05% IV型膠原酶在體灌注消化與減碎法相結(jié)合，充分利用兩種方法的優(yōu)勢(shì)而回避了兩種方法的弊端，既保證了實(shí)驗(yàn)的效果又提高了實(shí)驗(yàn)的可操作性；②在30%、60% Percoll密度梯度離心之后加入40% Percoll工作液進(jìn)一步純化的實(shí)驗(yàn)步驟，能有效的分離出混入的雜細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步純化有非常好的效果；③在前人的基礎(chǔ)上，精簡(jiǎn)了實(shí)驗(yàn)操作步驟，盡量縮短實(shí)驗(yàn)的操作時(shí)間，可以大大提高細(xì)胞的提取量及活力。

綜上所述，本研究摸索了一套改良KCs分離和鑒定的方法，綜合膠原酶在體灌注和離體消化、密度梯度離心和選擇性貼壁法，機(jī)械分離和振蕩孵育各種方法優(yōu)點(diǎn)，最大程度的消化肝組織，保證KCs純度及活力能進(jìn)一步用于其他實(shí)驗(yàn)，操作步驟簡(jiǎn)便易行，能更好的為其他實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

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(2014-10-21 收稿 2015-01-04 修回)

Improvement of isolation and cultivation of liver Kupffer cells of SD rats

LiLiang,PengQiong,DaiFu

DepartmentofGastroenterology,theThirdAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity(theFirstPeople′sHospitalofHefeiCity),HeFei230022,China

Objective To explore the effects of Kupffer cells (KCs) on various liver diseases by building a simple, efficient, practical and stable method for extraction and primary culture of KCs in SD rats. Methods The liver of healthy male SD rats which weighted about 200 g was perfused in situ by 0.05% type IV collagenase and cut into small pieces; the fragments were vibrated 20 mins in water bath(37℃); 30% and 60% Percoll were used for density gradient centrifugation followed by 40% Percoll centrifugation to extract KCs; the purification of KCs was performed with plastic adherent at last. Cell morphology was observed under inverted microscope, and viability was detected by Trypan blue staining experiment; swallowing ink experiment was performed to observe phagocytosis, and flow cytometry was used for identification of purity. Results (1.00±0.20)×107(n=20) KCs were obtained per rat, the cells viability was (92.34± 0.15)%, and the purity was (93.56± 0.24)%. Conclusion The improved method has the advantages of simple operation and reliable effect, which lay the foundation for future research and thus is worth promotion.

Kupffer cells; Cell separation; Primary culture; Cell identification

230011 安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(合肥市第一人民醫(yī)院)消化內(nèi)科

戴夫，hfsdf@sina.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.03.004