劉 龍

（鄭州大學(xué)體育學(xué)院，河南鄭州 450044）

超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）作為細(xì)胞中的一種抗氧化酶，在生物體清除氧自由基方面發(fā)揮著重要作用。氧自由基在生物體內(nèi)如果堆積過多，會造成細(xì)胞膜上脂質(zhì)發(fā)生過氧化，脂質(zhì)過氧化會導(dǎo)致細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，并進(jìn)一步會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和變性，導(dǎo)致生物體內(nèi)許多酶類和激素失去活性。氧自由基堆積過多還會破壞核酸的正常結(jié)構(gòu)。最終使機(jī)體代謝出現(xiàn)異常，出現(xiàn)一種退行性的變化，從而導(dǎo)致了衰老現(xiàn)象的發(fā)生［1－3］。SOD可以有效清除機(jī)體內(nèi)的有害自由基，及時修復(fù)受損傷的細(xì)胞和蛋白質(zhì)，對減緩機(jī)體衰老起著很重要的調(diào)控作用［4］。研究表明，衰老大鼠睪丸組織中包含SOD在內(nèi)的一些抗氧化酶活性均顯著降低［5］。睪丸組織中含有的SOD含量下降，還會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的抗氧化作用和氧化作用之間的平衡出現(xiàn)失調(diào)，并最終導(dǎo)致自由基的堆積，加速衰老［6］。適度運(yùn)動可以通過各種體制提高機(jī)體內(nèi)的SOD含量，從而清除體內(nèi)的自由基，延緩衰老的發(fā)生［7］，運(yùn)動通過影響外周血和生殖系統(tǒng)器官內(nèi)SOD的含量對有機(jī)體的新陳代謝起著重要的調(diào)控作用。

現(xiàn)今關(guān)于運(yùn)動與衰老的試驗(yàn)研究也有一定的報道，但大都側(cè)重于男性生殖系統(tǒng)與衰老的研究，有關(guān)適度運(yùn)動對外周血和女性生殖系統(tǒng)器官組織中SOD的影響及其與衰老的研究至今未見報道。本研究運(yùn)用免疫組化SP法檢測了雌性大鼠卵巢中SOD的表達(dá)并進(jìn)一步檢測了大鼠血清中SOD的濃度，為進(jìn)一步探討運(yùn)動與SOD的調(diào)控衰老提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康青春期雌性SD大鼠，體重240g～250g為河南省實(shí)驗(yàn)動物中心產(chǎn)品；兔抗鼠SOD多克隆抗體為南京建成生物所產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 將SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)管理，1周后用于試驗(yàn)。并隨機(jī)分為對照組、20、40、60、80min運(yùn)動組，共5個試驗(yàn)組。運(yùn)動形式為游泳，對照組大鼠不運(yùn)動，試驗(yàn)組大鼠每天分別運(yùn)動20、40、60、80min。每日進(jìn)行1次運(yùn)動，每周運(yùn)動5d，試驗(yàn)時間為20周。

1.2.2 取材及切片 各試驗(yàn)組訓(xùn)練20周后40mL／L的水合氯霉醛腹腔麻醉處死實(shí)驗(yàn)動物，頸動脈取血，制備血清備用。同時取各試驗(yàn)組大鼠卵巢，并迅速置于4℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40mL／L的多聚甲醛磷酸緩沖液固定12h～24h后。對固定的卵巢做石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，切片片厚5μm，取其中的2套。第1套行進(jìn)行免疫組化SP法染色；第2套用PBS代替一抗，作為對照。

1.2.3 主要試劑及免疫組化操作程序 一抗為兔抗鼠SOD多克隆抗體（1∶100稀釋，為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品），切片脫蠟復(fù)水，按抗體要求和試劑盒操作說明進(jìn)行免疫組化操作。最后用梯度乙醇脫水干燥后，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照切片染色按照免疫組織化學(xué)SP法的染色步驟進(jìn)行處理，只是把步驟中加入的兔抗大鼠SOD抗體用PBS液代替，其余步驟完全相同，陰性對照用0.01mol／L的PBS緩沖液代替一抗，用DAB顯色，然后貼片，進(jìn)行梯度酒精脫水，用二甲苯透明后置于顯微鏡下觀察。

1.2.4 結(jié)果判斷及統(tǒng)計學(xué)處理 SOD測定時，設(shè)空白管（不加亞硝酸鈉和標(biāo)本）、標(biāo)準(zhǔn)管（加入20μmol／L的亞硝酸鈉）和測定管，往測定管內(nèi)加0.3mL的待測血清。各管混勻放置10min后，3 500r／min～4 000r／min離心10min，然后取上清液0.8mL，37℃恒溫水浴40min，加入顯色劑混勻，10min以后倒入1cm的光徑比色杯中，用蒸餾水調(diào)零，用酶標(biāo)儀于波長550nm處比色。并按公式［SOD活力NU／mL（亞硝酸鹽單位／mL）＝（A對照管－A測定管）÷A對照管÷50%×稀釋液倍數(shù)］，計算SOD活力［8］。免疫組化反應(yīng)中有藍(lán)色顆粒者為陽性，切片中陰性表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)不顯色。圖片分析時隨機(jī)選取10個相同部位不同切片的高倍鏡視野（400×），用江蘇捷達(dá)高清晰的圖像分析系統(tǒng)分析，并計算出每一個視野的陽性強(qiáng)度均值（陽性強(qiáng)度均值用平均吸光度表示）和陽性面積，然后計算出相對的表達(dá)量μ2均值（μ2＝光鏡倍數(shù)×陽性強(qiáng)度均值×陽性面積／260 000）［8］，公式中260 000表示像素。最終計量資料應(yīng)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±SD）表示，統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用t檢驗(yàn)法比較出各組大鼠卵巢中SOD的表達(dá)，P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 SOD濃度測定結(jié)果

與對照組相比，20min運(yùn)動訓(xùn)練組與0min運(yùn)動組相比無顯著性差異，80min運(yùn)動訓(xùn)練組大鼠血清中SOD濃度較低而差異顯著（P＜0.05）；40min和60min運(yùn)動組大鼠血清中SOD的濃度與對照組相比較高而差異顯著（P＜0.05）同時，40min運(yùn)動訓(xùn)練組與60min運(yùn)動訓(xùn)練組之間差異不顯著（P＞0.05），但二者分別與20min運(yùn)動訓(xùn)練組和80min運(yùn)動訓(xùn)練組之間有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。

表1 運(yùn)動對大鼠血清中SOD濃度的影響Table 1 Effect of exercise on SOD concentration in the serum of rats

2.2 SOD在不同運(yùn)動組大鼠卵巢中的表達(dá)結(jié)果

在對照組大鼠卵巢黃體的顆粒性黃體細(xì)胞中SOD免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為藍(lán)色強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性胞體內(nèi)深藍(lán)色的陽性表達(dá)產(chǎn)物融合為團(tuán)狀，陽性顆粒染成一片，陽性細(xì)胞體間的輪廓清晰，陽性細(xì)胞中陽性產(chǎn)物定位在胞膜和部分胞質(zhì)，胞核不著色呈現(xiàn)空泡狀（圖1A）。40min和60min運(yùn)動組大鼠的顆粒性黃體細(xì)胞中SOD免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)黑色的強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞多為聚集或分散存在，陽性細(xì)胞呈不規(guī)則的圓形、卵圓形以及梭形等（圖1C和圖1D）。在20min和80min運(yùn)動組大鼠的卵巢粒性黃體細(xì)胞中SOD免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物均呈藍(lán)色的弱陽性表達(dá)，陽性表達(dá)的細(xì)胞體輪廓模糊不清，用高倍鏡才可以看到陽性細(xì)胞中含有少量的淺藍(lán)色陽性顆粒。陽性表達(dá)的細(xì)胞體多為不規(guī)則的圓形和卵圓形（圖1B和圖1E，表2）。

表2 SOD在不同實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢中的表達(dá)Table 2 The expression of SOD in the ovary of exprimental rats

圖1 SOD在不同運(yùn)動組大鼠卵巢中的表達(dá)Fig.1 The expression of SOD in the ovaries of different groups of rats

3 討論

SOD作為生物體內(nèi)的重要抗氧化酶，可清除細(xì)胞代謝過程中所產(chǎn)生的氧自由基，并可以降低氧自由基對細(xì)胞造成的損害，從而與機(jī)體的衰老機(jī)制的調(diào)控密切相關(guān)［9－10］。運(yùn)動本身可以對機(jī)體造成一種刺激，這種刺激會導(dǎo)致機(jī)體的功能和內(nèi)環(huán)境發(fā)生不同程度的應(yīng)激，運(yùn)動時間長短不同，對應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)弱也有一定的差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠短時間運(yùn)動20min后，其血液中SOD的濃度與0min運(yùn)動組相比略有增高而差異不顯著，說明，短時間運(yùn)動不能達(dá)到機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)閾值，對機(jī)體衰老也不會產(chǎn)生影響。但是隨著大鼠運(yùn)動時間開始增加，每日的運(yùn)動時間增加到40min，甚至增加到60min，大鼠血清中SOD濃度與對照組相比含量增高而有顯著性差異（P＜0.05）這一研究結(jié)果提示，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動可以促使有機(jī)體產(chǎn)生一些有利的應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的SOD，提高了細(xì)胞對氧自由基的清除作用，從而對機(jī)體起到了抗衰老的作用［11］。當(dāng)大鼠每日運(yùn)動時長增加到80min，血液中SOD濃度與0min運(yùn)動組相比卻沒有隨著運(yùn)動時間的延長而濃度增高，而是出現(xiàn)了明顯的降低（P＜0.05），提示，長時間運(yùn)動會使機(jī)體應(yīng)激過度而處于比較疲憊狀態(tài)，使得機(jī)體失去代償狀態(tài)的大量細(xì)胞不能產(chǎn)生相應(yīng)濃度的SOD，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量氧化物堆積而不能及時清除，不但不能對衰老起到延緩作用，還會對機(jī)體產(chǎn)生一定程度的損傷作用。

運(yùn)動本身是一種強(qiáng)烈的刺激性活動，會造成機(jī)體的耗氧和耗能增加，而產(chǎn)生一定的自由基。SOD在清除氧自由基過程中會大量消耗，有機(jī)體則可以通過正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制增強(qiáng)細(xì)胞SOD的表達(dá)。在本研究中，20min運(yùn)動組卵巢黃體中SOD的表達(dá)與對照組之間無顯著性的差異（P＞0.05）。提示，隨著大鼠運(yùn)動時間的增加，機(jī)體相應(yīng)的會提高SOD的表達(dá)以應(yīng)對其不斷的消耗，但由于運(yùn)動時間較短，體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基數(shù)量較少，短時間不能達(dá)到反饋調(diào)節(jié)閾值，因此，SOD的水平?jīng)]有增加。隨著運(yùn)動時間的進(jìn)一步增加，當(dāng)增加到40min和60min時，細(xì)胞在耗氧和耗能過程中會產(chǎn)生大量氧自由基，細(xì)胞內(nèi)儲存的SOD會消耗殆盡。為平衡機(jī)體代謝，細(xì)胞會做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)［12］，以提高SOD的表達(dá)，增加細(xì)胞SOD的含量，減少氧自由基的損傷［13－14］。但是，隨著運(yùn)動時間的進(jìn)一步增加，當(dāng)運(yùn)動時間增加到80min時，運(yùn)動訓(xùn)練組大鼠較對照組卵巢黃體中SOD水平有所降低而差異顯著（P＜0.05）。長時間運(yùn)動會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SOD水平消耗過多，或者是由于清除氧自由基會消耗大量SOD，使其在體內(nèi)的含量降低。

綜上所述，當(dāng)機(jī)體受到運(yùn)動刺激時，細(xì)胞內(nèi)會迅速產(chǎn)生大量氧自由基，消耗了細(xì)胞內(nèi)儲存的SOD。隨著運(yùn)動時間的延長，細(xì)胞耗氧耗能增加，最終導(dǎo)致胞內(nèi)儲存的SOD消耗殆盡，細(xì)胞開始出現(xiàn)一系列適應(yīng)性反應(yīng)，以增加細(xì)胞內(nèi)SOD的水平，減少氧自由基對機(jī)體的損傷，隨著運(yùn)動時間的進(jìn)一步延長，有機(jī)體開始處于過度疲憊狀態(tài)，機(jī)體內(nèi)失去代償狀態(tài)的大量細(xì)胞不能產(chǎn)生足夠的SOD，使機(jī)體內(nèi)SOD水平下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的過氧化物堆積和細(xì)胞損傷。

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