林玲 楊春亮 查玉兵 郭宏斌 曾紹東 曾日中

摘要 [目的]建立一種測(cè)定芒果果實(shí)中多菌靈殘留量的高效液相色譜法。[方法]利用高效液相色譜法測(cè)定芒果不同噴藥時(shí)間多菌靈的殘留量，外標(biāo)法定量。[結(jié)果]多菌靈農(nóng)藥殘留較高，且基本上呈施藥后間隔期越短，農(nóng)藥殘留越高的趨勢(shì)。采前7 d多菌靈農(nóng)藥殘留達(dá)到1.20 mg/kg，間隔期7～30 d多菌靈殘留介于0.09～1.20 mg/kg，采前35 d多菌靈殘留量為未檢出。多菌靈的檢出限為0.02 mg/kg，平均回收率在85%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4%。[結(jié)論]該方法準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，能滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留分析要求。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜；多菌靈；芒果

中圖分類(lèi)號(hào) S481+.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）27-113-02

Determination of Carbendazim Residue of Different Interval in Mango Fruit by HPLC

LIN Ling1，2， YANG Chun-liang1，2*， ZHA Yu-bing1，2 et al

（1.Agriculture Products Processing Research Institute， CATAS， Zhanjiang， Guangdong 524001； 2.Laboratory of Agricultural Products Processing Quality and Safety Risk Evaluation， Ministry of Agriculture， Zhanjiang， Guangdong 524001）

Abstract [Objective] The aim was to establish a determination of Carbendazim residue in mango fruit by HPLC. [Method] The Carbendazim residue of different interval in mango fruit was determined by HPLC and external standard method. [Result] There was higher Carbendazim residue in mango fruit， furthermore the shorter spraying interval was， the higher Carbendazim residue was. The residue of Carbendazim reached 1.20 mg/kg in 7 days before harvest； the residues of Carbendazim were between 0.09 mg/kg and 1.20 mg/kg during the interval from 7 days to 30 days； carbendazim residue was not detected in 35 days before harvest. Under the selected conditions， the limit of Carbendazim detection was 0.02 mg/kg， and the average recoveries were 85%-105%， and relative standard deviation was less than 4%. [Conclusion] The method was accurate， simple and sensitive， and could satisfy the demand of pesticide residue analysis.

Key words HPLC； Carbendazim； Mango fruit

芒果是繼香蕉之后的世界第二大熱帶水果，有“熱帶果王”的美稱(chēng)。截至2009年底，我國(guó)芒果栽培總面積達(dá)13.11萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)89.41萬(wàn)t，種植面積和產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)。我國(guó)已成為世界芒果主產(chǎn)國(guó)之一，主要分布在海南、廣東、廣西、云南、四川攀枝花、福建等地區(qū)，是我國(guó)熱區(qū)農(nóng)民的重要經(jīng)濟(jì)來(lái)源之一。芒果在田間生長(zhǎng)及采后貯運(yùn)過(guò)程中遭受著多種病蟲(chóng)害。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道可危害芒果的病害就有50多種[1]。其中，炭疽病是其發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的一種病害，主要為害芒果葉片、嫩梢、花序和果實(shí)。同時(shí)，由于其病原菌具有潛伏侵染的特性，會(huì)從開(kāi)花期、幼果期侵入，在侵染果實(shí)的過(guò)程中以侵染性菌絲體、附著胞和（或）侵入釘?shù)惹秩窘Y(jié)構(gòu)在果實(shí)表面或表皮內(nèi)處于潛伏狀態(tài)，在果實(shí)的表面上沒(méi)有任何病害跡象，至果實(shí)貯運(yùn)期，隨著果實(shí)的后熟，侵染結(jié)構(gòu)又恢復(fù)活動(dòng)，使果實(shí)迅速腐爛，甚至整個(gè)果實(shí)失去食用價(jià)值，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

多菌靈是一種高效、低毒、廣譜內(nèi)吸性苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，兼具防治兩重作用，是用于防治炭疽病的理想藥劑[2]。除了農(nóng)藥對(duì)病蟲(chóng)害的防治效果外，農(nóng)藥的安全使用問(wèn)題也日益得到人們的關(guān)注，目前，國(guó)內(nèi)外已制定多種農(nóng)產(chǎn)品中多菌靈殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟許多國(guó)家和我國(guó)相繼對(duì)蔬菜、水果中的多菌靈最高殘留限量進(jìn)行了規(guī)定[3]。測(cè)定多菌靈殘留量的常用檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法和高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法，樣品主要集中在蔬菜、水果、茶葉、藥材等方面[4-8]。關(guān)于多菌靈在芒果上的殘留檢測(cè)方面的研究目前未見(jiàn)報(bào)道。為了對(duì)多菌靈在芒果上的安全間隔期進(jìn)行合理評(píng)價(jià)，筆者利用高效液相色譜法對(duì)芒果不同噴藥時(shí)間多菌靈的殘留量進(jìn)行了測(cè)定，以期為生產(chǎn)上合理施用多菌靈農(nóng)藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

99.8%多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈、甲醇均為色譜純，二氯甲烷、氯化鈉等均為分析純。50%多菌靈可濕性粉劑：按其說(shuō)明書(shū)介紹的大田施用濃度配制藥液。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制。

1.2.1.1 甲醇+二氯甲烷溶液（5+95）。量取5.00 ml甲醇和95.00 ml二氯甲烷，混勻后備用。

1.2.1.2 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱(chēng)取10.0 mg多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品于25.00 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為0400 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃下避光保存。

1.2.1.3 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作液。量取適量多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.1.4 離子對(duì)試劑。吸取7.00 ml磷酸于200.00 ml水中，加入1.0 g 葵烷磺酸鈉，溶解，再加入10.00 ml三乙胺，稀釋至1 000 ml。

1.2.2 芒果田間噴霧處理。

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，選擇一片5年以上樹(shù)齡長(zhǎng)勢(shì)均勻的地塊，田間各項(xiàng)管理采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)控制。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理5棵樹(shù)，分別于采前35、30、25、20、15、7 d進(jìn)行噴霧處理，噴藥時(shí)間設(shè)在09：00～11：00，天氣為晴天，氣溫為25～33 ℃，藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑1 000倍稀釋液，用小型手提式噴霧器將配制好的藥劑均勻噴布于供試植株果實(shí)上，果實(shí)收獲時(shí)，對(duì)每個(gè)采前間隔期均隨機(jī)取5個(gè)果實(shí)進(jìn)行殘留檢測(cè)。

1.2.3 樣品的提取與凈化。

參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1680-2009[9]和NY/T 761-2008[10]并稍做修改。

1.2.3.1 提取。稱(chēng)取5.0 g打漿均勻的果肉，加入20.00 ml乙腈，加7.0 g氯化鈉，渦旋混合2 min，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心8 min，吸取5.00 ml乙腈離心液放入燒杯中，于80 ℃水浴中加熱氮吹，將乙腈蒸發(fā)近干，加入2.00 ml甲醇+二氯甲烷（5+95）溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

1.2.3.2 凈化。將氨基柱用4.00 ml甲醇+二氯甲烷（5+95）預(yù)洗后立即加入“1.2.3.1”待凈化液，收集洗脫液，再加入2.00 ml甲醇+二氯甲烷（5+95）溶解殘?jiān)筮^(guò)柱，并重復(fù)1次，將收集的洗脫液置于氮吹儀上，氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2.00 ml，混勻后用0.22 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.4 色譜條件。

Symmetry C18 250.0 mm×4.6 mm色譜柱，柱溫：30 ℃，Waters2996二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，流動(dòng)相比例為甲醇-水（40∶60，V/V），流速為1.0 ml/min。

1.2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。

取濃度為0.80 μg/ml的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，用二極管陣列檢測(cè)器在190～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.6 流動(dòng)相的選擇。

比較甲醇-離子對(duì)試劑和甲醇-水2種流動(dòng)相組成對(duì)目標(biāo)物色譜峰峰形和分離度的影響，確定最適宜的流動(dòng)相。

1.2.7 方法的線性關(guān)系和相關(guān)性。

對(duì)濃度為0.1、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/ml的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度（X）和其對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，確定方法的準(zhǔn)確度和相關(guān)系數(shù)。

1.2.8 精密度、回收率和最低檢出限。

取芒果對(duì)照空白樣品分別添加3個(gè)濃度水平的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品添加濃度分別為0.2、0.5和1.0 mg/kg，按“1.2.3”步驟處理，每個(gè)濃度做3個(gè)平行測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以3倍信噪比計(jì)算最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

按“1.2.5”的方法對(duì)190～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)多菌靈在275 nm處有最大吸收，且基線噪音相對(duì)較小，色譜峰的信噪比更理想。因此，選擇275 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的確定

結(jié)果表明，在甲醇-水體積比為40∶60的色譜條件下，目標(biāo)峰分離效果最好，基線較平穩(wěn)，且噪音干擾小，雜質(zhì)峰與多菌靈的峰能完全分開(kāi)。而采用甲醇-離子對(duì)試劑做流動(dòng)相，目標(biāo)峰也能分離，但離子對(duì)試劑不穩(wěn)定，峰有拖尾，基線噪聲大，所以選擇甲醇-水做流動(dòng)相。

2.3 方法的相關(guān)性評(píng)價(jià)

結(jié)果表明，多菌靈在0.10～4.00 μg/ml 范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。線性方程為Y=1 344X-1 125，相關(guān)系數(shù)（r）等于0.999 2，表明線性關(guān)系良好，可滿(mǎn)足定量分析的需要。

2.4 精密度、回收率和最低檢出限

標(biāo)準(zhǔn)、樣品加標(biāo)色譜分別見(jiàn)圖1、圖2。由表1可知，多菌靈回收率為85%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～3.9%。多菌靈的最低檢出限為002 mg/kg。

2.5 多菌靈在芒果果實(shí)上的殘留量

結(jié)果表明，多菌靈在芒果上的殘留較明顯。采前7 d多菌靈農(nóng)藥殘留最高，達(dá)到1.20 mg/kg，采前35 d多菌靈農(nóng)藥殘留量沒(méi)有檢出，采前15～30 d多菌靈殘留介于0.09～1.20 mg/kg，果實(shí)收獲時(shí)農(nóng)藥殘留量隨著間隔期的變化總體上呈現(xiàn)施藥后間隔期越短農(nóng)藥殘留越高的趨勢(shì)。

3 討論

隨著熱帶水果產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，尤其是熱帶大宗水果大面積的栽培，其病蟲(chóng)害問(wèn)題日益嚴(yán)重。而化學(xué)防治是病蟲(chóng)害防治的一項(xiàng)重要手段，然而有些殺蟲(chóng)、殺菌劑農(nóng)藥的不合理使用或?yàn)E用農(nóng)藥不僅起不到防治病蟲(chóng)害的目的，還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染等問(wèn)題。因此，人們對(duì)某種農(nóng)藥進(jìn)行藥效篩選、毒性測(cè)定的同時(shí)，還需要對(duì)其在某種水果或其他作物上的安全間隔期進(jìn)行研究，以免造成農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，危害人類(lèi)身體健康。

該研究采用Waters高效液相色譜法分析芒果果實(shí)中多菌靈的殘留量，使用甲醇-水為流動(dòng)相，添加回收率為85%～105%，最低檢出限為0.02 mg/kg。該方法準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，能滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留分析要求。

劉承蘭等[11]采用丙酮提取蘆筍樣品中的多菌靈和吡蟲(chóng)啉農(nóng)藥殘留，用石油醚和二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容。該法步驟較繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，提取溶劑用量大，色譜條件流動(dòng)相甲醇-水體積比為40∶60，與該研究所建立的色譜流動(dòng)相相似。李海飛等[12]用高效液相色譜法快速測(cè)定水果中的3種苯并咪唑類(lèi)殺菌劑（多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈）殘留量，用乙腈提取，樣品提取、色譜流動(dòng)相與該試驗(yàn)條件相似，但檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm。NY/T 761-2008[10]蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥多殘留的測(cè)定的前處理與該方法的前處理基本一致，只是該方法的操作更加簡(jiǎn)單，且該方法的色譜條件也更加優(yōu)化，又相對(duì)環(huán)保。精密度高、穩(wěn)定性好，回收率較高，說(shuō)明該研究的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，可用于分析芒果等水果中多菌靈的殘留量。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2014[13]食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量規(guī)定多菌靈農(nóng)藥在芒果中殘留最大限量為0.50 mg/kg，CAC對(duì)芒果的規(guī)定為2.00 mg/kg，而歐盟則規(guī)定為0.10 mg/kg。參照上述標(biāo)準(zhǔn)，該研究在采前7 d處理的多菌靈最大殘留量為1.20 mg/kg，采前30 d處理的多菌靈殘留量為0.09 mg/kg，低于國(guó)際上要求較嚴(yán)格的歐盟標(biāo)準(zhǔn)?？梢?jiàn)，多菌靈殺菌劑在芒果上的降解速度慢，安全間隔期較長(zhǎng)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，考慮到該藥劑的毒性，建議多菌靈在芒果上的安全使用時(shí)間是采前30 d施用，使該藥物殘留降到最低。該研究結(jié)果為指導(dǎo)芒果生產(chǎn)中合理、安全地施用多菌靈農(nóng)藥提供了參考。

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安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（27）：154-157，160

責(zé)任編輯 高菲 責(zé)任校對(duì) 李巖