許妍妍，董 宇，王 新，彭 飛，孫曉靜，余少璟，辰巳英三，欒廣忠

(1.西北農(nóng)林科技大學 食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2.開封市食品藥品檢驗所，河南開封 475000；3.日本國際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心，日本筑波 305-8686)

β-伴大豆球蛋白α′-亞基的基因克隆及原核表達

許妍妍1，董 宇2，王 新1，彭 飛1，孫曉靜1，余少璟1，辰巳英三3，欒廣忠1

(1.西北農(nóng)林科技大學 食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2.開封市食品藥品檢驗所，河南開封 475000；3.日本國際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心，日本筑波 305-8686)

為制備N-連接糖基缺失的重組β-伴大豆球蛋白α′-亞基，以‘魯96150’大豆種子為原料提取總RNA，經(jīng)RT-PCR一步法獲得‘魯96150’大豆的全長cDNA，采用自行設(shè)計的引物F1/F2擴增得到目的基因α′，與pGEM-T easy載體相連構(gòu)建重組克隆載體pGEM-α′，經(jīng)XhoⅠ/EcoRⅠ雙酶切得到目的基因與載體pET-28a連接構(gòu)建重組原核表達載體pET-28a-α′，將經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定正確的表達載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達重組蛋白α′-亞基。對重組α′-亞基的誘導表達條件進行篩選，發(fā)現(xiàn)在菌液OD600值為0.8、誘導溫度30 ℃、IPTG濃度為0.2 mmol/L的誘導條件下誘導9 h后α′-亞基的表達量較高，重組α′-亞基的分子質(zhì)量大小約為70 ku；工程菌pET-28a-α′-BL21經(jīng)超聲破碎、離心后發(fā)現(xiàn)重組α′-亞基部分存在于上清液中，部分形成包涵體蛋白。重組α′-亞基的克隆及表達為β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的研究奠定基礎(chǔ)。

β-伴大豆球蛋白；亞基；重組蛋白；克??；基因表達

β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)是大豆蛋白的主要組分之一，由α′-亞基(71 ku)、α-亞基(67 ku)及β-亞基(50 ku)3種亞基通過疏水作用和氫鍵構(gòu)成三聚體；這3種亞基的含量對大豆蛋白的功能特性有顯著影響。根據(jù)3種亞基氨基酸序列的相似性，α-及α′-亞基在結(jié)構(gòu)上可分為延伸區(qū)(extension region)和核心區(qū)(core region)而β-亞基不具有延伸區(qū)，α′-亞基與α-亞基分別含有2個N-連接的糖基而β-亞基只含有1個N-連接糖基[1-4]。N-連接糖基對β-伴大豆球蛋白α′-亞基功能特性影響的研究較為少見。Maruyama等[5]利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備得到N-連接糖基缺失的重組蛋白α′-亞基及α′-亞基核心區(qū)，發(fā)現(xiàn)α′-亞基N-連接糖基及延伸區(qū)的缺失均不會影響重組α′-亞基自組裝成三聚體；β-伴大豆球蛋白是7S大豆球蛋白的主要成分，親水性較強的糖基可能會阻礙7S大豆球蛋白相互凝聚[6]，去除β-伴大豆球蛋白上的糖基可能會提高7S大豆球蛋白的凝膠能力。本研究選取‘魯96150’大豆種子為原料提取大豆總RNA，利用原核表達系統(tǒng)對β-伴大豆球蛋白的α′-亞基進行克隆與表達，制備得到N-連接糖基缺失的重組α′-亞基，為探究β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆‘魯96150’由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院提供；感受態(tài)細胞E.coliDH5α，天根生化科技北京有限公司；E.coliBL21(DE3)，北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen Biotech)；質(zhì)粒pGEM-T easy，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司(promega)；質(zhì)粒pET-28a由西北農(nóng)林科技大學食品學院微生物發(fā)酵實驗室提供。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：植物總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、rTaqDNA 聚合酶、DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA M arker、Quick Cut限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ，大連TaKaRa公司；蛋白胨、酵母粉，賽默飛世爾科技公司；T4-DNA 連接酶，NEB公司；DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白質(zhì)分子量Marker(MP102)，天根生化科技北京有限公司；瓊脂粉、瓊脂糖、β-巰基乙醇、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)，北京索萊寶有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：DYY-6C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Hema 9700 PCR 擴增儀，珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像儀，美國伯樂BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 NCBI官網(wǎng)中查找β-伴大豆球蛋白α′-亞基的基因序列(GB 編號為AB234094.1)，根據(jù)α′-亞基的編碼基因序列設(shè)計1對引物[5,7]，即上游引物F1：5′-CGGAC-GACGACGACAAGGTGGAGGAAGAAGAAG-AA-3′，下游引物F2：5′-CCGCTCGAGTCAGTAAAAAGCCCTCAAAATT-3′。上游引物F1引入腸激酶酶切位點(劃橫線部分堿基)及相應(yīng)保護堿基，下游引物F2引入限制性內(nèi)切酶XhoI酶切位點(劃橫線部分堿基)、終止密碼子(劃虛線部分堿基)及相應(yīng)的保護性堿基，擴增所得基因片段理論大小為 1 683 bp，引物由大連TaKaRa公司合成。

1.3.2 大豆總RNA提取及目的基因擴增 取200 mg‘魯96150’大豆種子凍干粉提取總RNA，以大豆總RNA 為模板采用試劑盒中隨機引物構(gòu)建cDNA文庫。反應(yīng)條件：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃保溫5 min，4 ℃保溫。以cDNA為模板用引物F1/F2擴增得到目的基因α′，采用10 g/L 的瓊脂糖凝膠檢測后回收目的基因片段，PCR反應(yīng)體系50 μL：10×PCR BufferⅡ 5 μL,dNTP mixture(10 mmol/L each) 2 μL,上游引物(20 μmol/L)0.5 μL，下游引物(20 μmol/L) 0.5 μL,TaKaRa ExTaqHS(5 U/μL)0.5 μL，上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2.5 μL，無菌純水補加50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

1.3.3 重組克隆載體pGEM-α′的構(gòu)建、篩選及鑒定 利用T4-DNA 連接酶將α′基因片段與克隆載體pGEM-T easy相連，反應(yīng)體系：α′基因片段3.5 μL，克隆載體pGEM-T easy質(zhì)粒0.5 μL，T4-DNA 連接酶1 μL，2×T4-DNA連接酶 Buffer 5 μL，總體積為10 μL。將該連接體系置于4 ℃條件下反應(yīng)14 h后導入到感受態(tài)細胞E.coliDH 5α。從含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中隨機挑取單個白色克隆菌落，用于菌落PCR篩選。菌落PCR反應(yīng)體系(25 μL)：13 μL聚合酶 rTaqmix，1 μL單克隆菌株菌液，1 μL上游引物F1，1 μL下游引物F2，補加去離子水至終體積。將篩選得到的陽性克隆菌株接種于氨芐青霉素為100 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，后用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定。首先利用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒酶切1 h，經(jīng)檢測其可被切分成單一條帶，之后加入EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶繼續(xù)酶切。將鑒定結(jié)果正確的陽性菌株送樣測序(由上海桑尼生物科技有限公司完成)，將pGEM-α′測序結(jié)果與 GenBank上α′-亞基基因編碼區(qū)進行序列比對，最終確認重組克隆載體[8]。將構(gòu)建成功的重組克隆載體命名為pGEM-α′，將測序正確的陽性克隆菌株37 ℃增菌培養(yǎng)后于-80 ℃保存菌種。

1.3.4 重組表達載體pET-28a-α′的構(gòu)建、篩選及鑒定 將pGEM-α′和pET-28a載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切，酶切反應(yīng)體系(25 μL)：限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/XhoⅠ各0.5 μL，10×QuickCut Green Buffer緩沖液1 μL，待酶切載體5 μL，補加超純水至終體積。分別將pGEM-α′與pET-28a的雙酶切體系置于37 ℃下反應(yīng)1 h后回收，雙酶切產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，之后回收帶有雙黏性末端的目的片段。

將雙酶切產(chǎn)物α′和pET-28a在T4-DNA連接酶作用下16 ℃連接14 h，連接體系(20 μL)：5 μL雙酶切產(chǎn)物α′，3 μL雙酶切產(chǎn)物pET-28a，T4-DNA連接酶1 μL，T4-DNA連接酶10×Buffer 2 μL，超純水9 μL。將連接產(chǎn)物導入E.coliBL21(DE3)中，設(shè)置空白與陽性對照。將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含卡那霉素(Kana)50 μg/mL固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)14 h。隨機挑取單克隆菌落，利用引物 F1/F2和T7/T7Ter進行菌落PCR篩選。將陽性菌株接種于含50 μg/mL卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，后經(jīng)電泳及EcoRⅠ/XhoⅠ單酶切及雙酶切鑒定，將鑒定結(jié)果正確的菌株送樣測序。將測序結(jié)果正確的重組表達載體命名為pET-28a-α′，陽性菌株命名為pET-28a-α′-BL21，挑選單菌落，37 ℃增菌培養(yǎng)后-80 ℃保存菌種[9-10]。

1.3.5 重組蛋白α′-亞基表達條件的篩選 將培養(yǎng)12 h的pET-28a-α′-BL21菌液按體積分數(shù)為1%接種量接種至液體LB培養(yǎng)基(Kana終質(zhì)量濃度50 μg/mL)中，選取誘導前不同菌液濃度(OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4)、不同誘導溫度(20、25、30、37 ℃)、不同誘導劑IPTG濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L)、不同誘導時間(3、6、9、21、24、27 h)對誘導表達條件進行篩選，取1 mL誘導菌液進行SDS-PAGE檢測，用體積分數(shù)為12.5%分離膠和體積分數(shù)5%濃縮膠，體系為29∶1，利用Quantity One軟件分析目的蛋白的表達量[9-11]。

1.3.6 重組蛋白α′-亞基存在形式判定 將pET-28a-α′-BL21培養(yǎng)至菌液OD600值在0.8左右，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導表達，分別于20、25、30、37 ℃下培養(yǎng)8 h，6 000 r/min離心20 min收集菌體，用磷酸鹽緩沖液PBS(25 mmol/L 磷酸鈉緩沖液Na2HPO4和NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，0.02% NaN3，pH=7.4)重懸后冰浴超聲波破碎菌體。超聲條件：振幅40，10 s/2 s，10 min，超聲4個循環(huán)后取出，靜置于4 ℃冰箱12 h后，在4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，取其上清液為目的蛋白α′的粗蛋白液，于4 ℃保存，將上清和沉淀進行SDS-PAGE分析[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆總RNA的提取

以大豆 ‘魯96150’為原料，利用植物總RNA快速提取試劑盒提取大豆總RNA，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。圖1中2條清晰條帶分別為28S和18S rRNA，第1個條帶(28S)的亮度明顯高于第2個條帶(18S)，所得大豆總RNA可用于RT-PCR。

2.2 目的基因α′-亞基的擴增

以大豆總RNA為模板，利用引物F1/F2經(jīng)RT-PCR擴增得到目的基因α′。圖2中擴增所得基因片段位于2 000 bp與1 500 bp之間與α′-亞基基因的理論大小相符，成功擴增得到α′-亞基基因片段。

2.3 重組克隆載體pGEM-α′的構(gòu)建、篩選及鑒定

選取編號為1號、2號的單克隆菌株，以自身引物F1/F2和pGEM-T Easy通用測序引物MR(48)/MF(47)對重組克隆載體pGEM-α′進行菌落PCR篩選，結(jié)果見圖3-A所示，擴增所得條帶均與目的基因片段大小一致。圖3-B為pGEM-α′經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶單酶切、雙酶切結(jié)果示意圖，泳道1中的重組克隆載體pGEM-α′質(zhì)粒大小在7 000 bp和4 000 bp之間，與重組克隆載體的理論大小一致；2、3號泳道為pGEM-α′經(jīng)過EcoRⅠ、XhoⅠ單酶切結(jié)果，重組質(zhì)粒pGEM-α′均能被切成單一條帶；EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切的4號泳道有2個清晰的條帶，一條約為3 000 bp與pGEM-T Easy 載體(2 867 bp)相一致，另一條與RT-PCR擴增所得目的基因片段α′-亞基的位置相一致，由此說明pGEM-α′中目的基因α′的連接方向正確，EcoRⅠ酶切位點成功引入。圖3-C中空載體pET-28a經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切和經(jīng)過XhoⅠ單酶切后均呈單一條帶，pET-28a經(jīng)雙酶切后未出現(xiàn)2條基因條帶，這可能是因為pET-28a經(jīng)雙酶切后的片段太小而無法檢測到[13]。

M.DL 5 000 DNA marker；1.大豆總RNA Total RNA of soybean

圖1 大豆總RNA提取結(jié)果
Fig.1 Total RNA of soybean

M.DL 5 000 DNA marker；1.α′-亞基基因片段 The gene segment of α′ subunit

圖2 目的基因片段α′的擴增結(jié)果
Fig.2 Amplification of α′ gene by RT-PCR

A.菌落PCR鑒定 The colony PCR identification;M.DL 5 000 DNA marker；1、3、5.單克隆菌株1號、2號以及空白利用引物F1/F2的PCR擴增結(jié)果 The colony PCR of the monoclonal bacteria colony No.1,No.2 and the blank in the 1,3,5 lane respectively by F1/F2;2、4、6.單克隆菌株1號、2號以及空白利用引物MR (48)/MF (47)的擴增結(jié)果 The colony PCR of the monoclonal bacteria colony No.1,No.2 and the blank in the 2,4,6 lane respectively by MR (48)/MF (47).

B.重組克隆載體pGEM-α′質(zhì)粒及酶切鑒定 The restriction enzyme digestion of the recombinant cloning vector pGEM-α′；M.DL 10 000 DNA marker；1.重組克隆載體pGEM-α′ The recombinant cloning vector pGEM-α′；2～4.pGEM-α′分別經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ單酶切、雙酶切 The pGEM-α′ restriction enzyme digestion byEcoRⅠ/XhoⅠ single enzyme and double enzyme digestion.

C.表達載體pET-28a酶切 The restriction enzyme digestion of the recombinant expression vector pET-28a；M.DL 5 000 DNA marker；1.表達載體pET-28a The recombinant expression vector pET-28a；2～4.pET-28a分別經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ單酶切、雙酶切 The restriction enzyme digestion of pET-28a byEcoRⅠ/XhoⅠ single enzyme and double enzyme digestion.

圖3 重組克隆載體pGEM-α′的篩選及鑒定
Fig.3 Screening and identification of the recombinant cloning vector pGEM-α′

2.4 重組表達載體pET-28a-α′的構(gòu)建、篩選及鑒定

選取編號為3～7的5個單克隆菌落，分別采用自身引物F1/F2和pET-28a通用測序引物T7/T7Ter進行菌落PCR擴增，重組表達載體菌落PCR篩選結(jié)果如圖4-A所示，經(jīng)F1/F2擴增得到的條帶約為1 700 bp而經(jīng)T7/T7Ter擴增得到的條帶約為2 000 bp，均與理論擴增條帶的大小相一致。如圖4-B所示重組表達載體pET-28a-α′經(jīng)EcoRI、XhoI單酶切后呈單一條帶，雙酶切得到2個大小不一條帶分別約為5 000 bp、1 700 bp與pET-28a載體(5 422 bp)、α′-亞基的基因片段(1 683 bp)大小相一致；測序所得堿基序列于NCBI 中進行Blast比對分析，該序列中目的基因共1 683個堿基與Gene Bank 編號為dbj|AB234094.1的α′-亞基編碼區(qū)215-1897的堿基一致性達到100%，未發(fā)生突變、移碼，目的基因片段α′-亞基正確連接到表達載體上。

A.重組表達載體pET-28a-α′菌落PCR鑒定 The colony PCR identification of the recombinant expression vector pET-28a-α′;M.DL 5 000 DNA marker；1～10.單克隆菌株3～7號分別以T7/T7ter和F1/F2為上下游引物的菌落PCR結(jié)果 The colony PCR of the monoclonal bacteria colony No.3-7 by T7/T7terand F1/ F2.

B.重組表達載體pET-28a-α′雙酶切鑒定 The restriction enzyme digestion of the recombinant expression vector pET-28a-α′；M.DL 5 000 DNA marker；1～4為重組表達載體pET-28a-α′、pET-28a-α′經(jīng)EcoRⅠ單酶切、pET-28a-α′經(jīng)XhoⅠ單酶切、pET-28a-α′經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切結(jié)果 The recombinant expression vector pET-28a-α′；2-4.The restriction enzyme digestion of the pET-28a-α′ byEcoRⅠ/XhoⅠ single enzyme and double enzyme digestion.

圖4 重組表達載體pET-28a-α′的篩選及酶切鑒定
Fig.4 Screening and identification of the recombinant expression vector pET-28a-α′

2.5 重組α′-亞基的存在形式

將pET-28a-α′-BL21菌培養(yǎng)至OD600為0.8，加入IPTG至終濃度為0.2 μmol/mL，分別于20、25、30、37 ℃下培養(yǎng)8 h，后經(jīng)超聲波破碎。如圖5所示，空載體菌及為未添加誘導劑的工程菌pET-28a-α′-BL21，于70 ku左右處均未出現(xiàn)目的蛋白。分別于20、25、30、37 ℃下誘導培養(yǎng)的菌體超聲后的上清液和沉淀中，于70 ku處均出現(xiàn)蛋白條帶；在誘導溫度為20～37 ℃，降低誘導溫度無法改善部分包涵體的生成，降低包涵體形式重組α′-亞基蛋白含量的方法需要進一步探究；上清液含有部分重組α′-亞基蛋白，具有較好的溶解性，可用于后期重組α′-亞基的分離純化[14]。

M.蛋白質(zhì)marker Protein marker；1～2.空載體菌、未誘導菌 Empty carrier bacteria,non-induced bacteria；3～14.分別為20、25、30、37 ℃下誘導的全菌、沉淀、上清 The bacteria,precipitation and supernatant induced by 20,25,30 and 37 ℃ respectively.

圖5 誘導溫度對重組α′-亞基存在形式的影響
Fig.5 Influence of the recombinant α′-subunit forms at different induction temperatures

2.6 重組α′-亞基表達條件的篩選

重組α′-亞基誘導條件的篩選結(jié)果如圖6-A所示，當OD600值為0.8，誘導溫度為20、25、30、37 ℃下α′-亞基的含量分別達到26.7%、28.3%、30.2%、26.6%，誘導溫度為30 ℃下重組α′-亞基的含量最高；當IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μmol/mL時，α′-亞基含量分別為22.7%、21.6%、22.6%、22.4%、21.2%、21.4%，添加誘導劑IPTG工程菌才會產(chǎn)生重組α′-亞基，當IPTG濃度在0.2～1.2 μmol/mL，加大誘導劑濃度無法顯著提高目的蛋白的含量；如圖6-B所示，當OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4時，重組α′-亞基的含量先呈逐漸升高后降低形勢之后又呈升高后降低形勢，分別達到10.3%、24.3%、28.9%、30.9%、27.4%、29.4%、22.6%，當OD600值為0.8時重組α′-亞基的含量最高；如圖6-C所示，當誘導時間為9 h時，α′-亞基的含量最高達到31.6%，隨著誘導時間的延長菌體濃度逐漸升高，因此延長誘導時間也可以獲得大量的目的蛋白。

A.誘導溫度及誘導劑IPTG濃度對重組α′-亞基的影響 The influence of induction temperature and IPTG concentration on the recombinant α′ subunit;M.蛋白質(zhì)marker Protein marker；1.空載體菌 Empty carrier bacteria；2～5.分別為誘導溫度為20、25、30、37 ℃的菌體蛋白 The bacteria induced by 20,25,30 and 37 ℃ respectively；6.空載體菌 Empty carrier bacteria；7～13.誘導劑IPTG濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μmol/mL The bacteria induced by IPTG concentration 0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 μmol/mL.

B.菌體濃度OD600值對重組α′-亞基的影響 The influence of OD600value on the recombinant α′ subunit：M.蛋白質(zhì)marker Protein marker；1.空載體菌 Empty carrier bacteria；2～8.OD600值分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 The bacteria induced by OD600value 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 and 1.4 respectively.

C.誘導時間對重組α′-亞基的影響 The influence of induction time on the recombinant α′ subunit：M.蛋白質(zhì)marker Protein marker；1.空載體菌 Empty carrier bacteria；2～7.誘導時間分別為3、6、9、21、24、27 h The bacteria induced by 3,6,9,21,24 and 27 h respectively.

圖6 不同誘導條件對重組α′-亞基表達的影響
Fig.6 Influence of the α′ subunit expression and forms at different induction conditions

3 結(jié)論與討論

本研究從大豆‘魯96159’中提取總RNA，采用自行設(shè)計的引物F1/F2經(jīng)RT-PCR一步法擴增獲得β-伴大豆球蛋白α′-亞基的基因片段，成功構(gòu)建帶有EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點的重組克隆載體pGEM-α′和重組表達載體pET-28a-α′；2種重組載體經(jīng)菌落PCR鑒定、雙酶切鑒定以及堿基序列鑒定均正確。將重組表達載體pET-28a-α′轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)誘導表達獲得分子量約為70 ku的重組α′-亞基。經(jīng)篩選獲得重組α′-亞基的表達條件分別為：IPTG濃度為0.2 mmol/L、誘導溫度30 ℃、誘導時間9 h并且OD600值為0.8。部分重組α′-亞基未形成包涵體存在于上清液中，有利于后期重組α′-亞基蛋白的分離純化。

陽性工程菌pET-28a-α′-BL21所表達的重組α′-亞基分別存在于超聲破碎的上清液和沉淀中，在溫度為20～37 ℃，降低誘導溫度對重組α′-亞基包涵體的生成沒有顯著影響；誘導劑濃度在0.2～1.2 μmol/mL，提高誘導劑濃度對重組α′-亞基的表達量無顯著影響；由于誘導溫度及誘導劑濃度對表達蛋白包涵體形式的生成具有重要影響，因此，可以通過進一步降低誘導溫度及誘導劑濃度來降低包涵體形式重組α′-亞基的含量。由于包涵體形式的重組蛋白的溶解性較差，需進行較為繁瑣的后期處理復性，為獲得大量無包涵體形式的重組α′-亞基、提高重組α′-亞基的得率，探究β-伴大豆球蛋白α′-亞基在E.coli中的表達機理是十分必要的。

重組α′-亞基蛋白的N-端引入表達載體pET-28a自身所攜帶的His-Tag標簽，可采用Ni2+親和層析柱[13]或Ni2+磁性微球[15]純化重組α′-亞基蛋白，提高后期的純化效率；在設(shè)計上游引物F1時，在重組α′-亞基N-端的第1個氨基酸之前引入了腸激酶酶切位點，可以利用腸激酶定向?qū)⒈磉_載體pET-28a自身所攜帶的組氨酸標簽及多余氨基酸切除；下游引物引入終止密碼子，避免pET-28a的氨基酸連接到重組α′-亞基蛋白的C-端，獲得氨基酸序列完整的重組蛋白α′-亞基，為重組α′-亞基蛋白理化及功能特性的研究做準備。

Reference：

[1] WOLF W J,BABCOCK G E,SMITH A K.Ultracentrifugal differences in soybean protein composition [J].Nature,1961,191(4796):1395-1396.

[2] DERCY S E,WRIGHT D B,BLOULTER L.Storage protein of legume seeds [J].Phytochemistry,1976,15(1):3-24.

[3] UTSUMI S,KINSELLA J E.Structure function relationship in food proteins:subunit interaction in heat-induced gelation of 7S,11S,and soy isolate proteins [J].JournalofAgricultureandFoodChemistry,1985,33(2):297-303.

[4] CONSONNI A,LOVATI M R,PAROLARI A,etal.Heterologous expression and purification of the soybean 7S globulin α' subunit extension region:in vitro evidence of its involvement in cell cholesterol homeostasis[J].ProteinExpressionandPurification,2011,80(1):125-129.

[5] MARUYAMA N,KATSUBE T,WADA Y,etal.The roles of the N-linked glycans and extension regions of soybean β-conglycinin in folding,assembly and structural features [J].EuropeanJournalofBiochemistry,1998,258(2):854-862.

[6] 欒廣忠.堿性蛋白酶Alcalase凝固豆?jié){機理的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2005:56-62.

LUAN G ZH.Studies on the mechanism of soymilk coagulation by an alkaline proteinase Alcalase[D].Beijing:China Agricultural University,2005:56-62(in Chinese with English abstract).

[7] LIU Y,REN L M,GE L M,etal.Strategy for fusion expression and preparation of functional glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogue by introducing an enterokinase cleavage site[J].BiotechnologyLetters,2014,36(8):1675-1680.

[8] 陳浩然,王增鑫,王雅君,等.重組E.coliL-天冬酰胺酶的克隆及表達與純化[J].濟南大學學報(自然科學版),2015,29(1):22-25.

CHEN H R,WANG Z X,WANG Y J,etal.Cloning,expression and purification of recombinedE.coliL-Asparaginase[J].JournalofUniversityofJinan(ScienceandTechnologyEdition) ,2015,29(1):22-25 (in Chinese with English abstract).

[9] 玉佳男,田 晶,李寶麗,等.變形鏈球菌UA159葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶B催化活性區(qū)的基因克隆及表達[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(5):71-75,129.

YU J N,TIAN J,LI B L,etal.Gene cloning and expression of the catalytic region of glycosyltransferase B fromStreptococcusmutansUA159[J].ModernFoodScienceandTechnology,2015,31 (5):71-75,129(in Chinese with English abstract).

[10] 王 盼,費永濤,劉冬梅,等.植物乳桿菌DMDL 9010中亞硝酸鹽還原酶的基因克隆、表達和純化[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(6):150-155,271.

WANG P,FEI Y T,LIU D M,etal.Cloning,expression,and purification of the nitrite reductase gene fromLactobacillusplantarumDMDL 9010[J].ModernFoodScienceandTechnology,2015,31(6):150-155,271(in Chinese with English abstract).

[11] LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriouhaae T4[J].Nature,1970,227:680-685.

[12] 王玉海,岳 娟,王 鵬,等.編碼米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在大腸桿菌中的重組表達[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(9):67-72,178.

WANG Y H,YUE J,WANG P,etal.Recombinant expression of fructosyl transferase gene ofAspergillusoryzaeinEscherichiacoli[J].ModernFoodScienceandTechnology,2014,30(9):67-72,178(in Chinese with English abstract).

[13] 嚴 萍,朱喜梅,李 璐,等.Mincle 受體蛋白克隆、原核表達與純化[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(3):77-83,76.

YAN P,ZHU X M,LI L,etal.Prokaryotic expression and purification of Mincle receotor protein[J].ModernFoodScienceandTechnology,2015,31(3):77-83,76(in Chinese with English abstract).

[14] 汪家政,范 明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京:科學出版社,2005:183.

WANG J ZH,FAN M.The Manual of Protein Technology[M].Beijing:Science Press,2005:183(in Chinese).

[15] 王文加,郭曉林,韋安慧,等.基于Fe3O4·SiO2/Ni-NTA磁性微球的His-tag融合蛋白純化體系的建立[J].高等學校化學學報,2012,33(2):303-307.

WANG W J,GUO X L,WEI A H,etal.Purification of Histidine-tagged fusion proteins based on Fe3O4·SiO2/Ni-NTA magnetic spheres [J].ChemicalJournalofChineseUniversities,2012,33(2):303-307(in Chinese with English abstract).

(責任編輯：史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

Cloning and Prokaryotic Expression of Soybean β-conglycinin α′-Subunit Gene

XU Yanyan1,DONG Yu2,WANG Xin1,PENG Fei1,SUN Xiaojing1,YU Shaojing1,Eizo Tatsumi3and LUAN Guangzhong1

( 1.College of Food Science & Engineering,Northwest A&F University1,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.Kaifeng Institute for Food and Drug Control,Kaifeng Henan 475000,China; 3.Japan International Research Center for Agricultural Science,Tsukuba 305-8686,Japan)

In order to build theE.coliexpression system for the α′ subunit of soybean β-conglycinin,the total RNA were extracted from the seeds of soybean variety ‘Lu 96150’.The α′ coding sequence was amplified by one step assay of RT-PCR,and then inserted into the vector of pGEM-T easy.After digested byXhoI/EcoRI,the α′ fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a containing His-tag.The constructed vector pET-28a-α′ was verified by the colony PCR,restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.Then the pET-28a-α′ vector was transformed intoE.colihost strain BL21 (DE3) for IPTG induction expression.A recombinant protein about 70 ku was well expressed by inducing with the OD600value 0.8,IPTG 0.2 mmol/L at 30 ℃ for 9 h.After ultrasonication and centrifuge the target protein α′ subunit was found in the supernatant not in the form of inclusion body,more convenient to the further purification work.This study could provide a theoretical basis for the structure and function relationship study of soybean β-conglycinin.

β-conglycinin; Subunit; Recombinant protein; Cloning; Gene expression

XU Yanyan,female,master student.Research area:soybean processing technology.E-mail:1175580375@qq.com

LUAN Guangzhong,male,Ph.D,associate professor.Research area:soybean,grain and oil processing technology.Email:qlgz@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1008.040.html

2016-05-14

2016-06-06

中日合作項目(K332021107)。

許妍妍，女，碩士研究生，研究方向為大豆深加工技術(shù)。E-mail：1175580375@qq.com

欒廣忠，男，博士，副教授，研究方向為大豆及糧油深加工技術(shù)。E-mail：qlgz@nwsuaf.edu.cn

TS201

A

1004-1389(2017)02-0304-07

Received 2016-05-14 Returned 2016-06-06

Foundation item Sino Japan Cooperation Project(No.K332021107).