黃麗俊　李利東　宓曉黎

摘要：對已有方法和規(guī)范中樣品前處理方法和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化和對比研究，建立檢測蟲草制品中腺苷和蟲草素含量的反相高效液相色譜方法。樣品經(jīng)水超聲提取40min，離心過濾后進(jìn)行分析。采用C₁₈色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），以水-甲醇（85：15，V/V）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為260nm。本方法檢測限為0.2μg/mL，定量限為1.0μg/mL。以所建立的方法對蟲草制品進(jìn)行分析，樣品加標(biāo)回收率在94%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。該檢測方法簡便、準(zhǔn)確，并能同時測定腺苷和蟲草素。

關(guān)鍵詞：蟲草制品；高效液相色譜；腺苷；蟲草素

中圖分類號：O657.7+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

論文編號：2014-0289

0引言

蛹蟲草為子囊菌亞門麥角菌目麥角菌科蟲草屬的模式種，又名北冬蟲夏草，可人工批量培育，與冬蟲夏草是同屬，2009年被批準(zhǔn)為新資源食品。由于蟲草具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用而引發(fā)人們的關(guān)注，并深度開發(fā)，目前市場上有以蟲草為原料的各類藥品、保健食品及食品，其劑型有含片、膠囊、口服液、固體飲料、酒等。中國藥典2010版冬蟲夏草項下腺苷含量測定采用HPLC法，CFDA用HPLC測定蛹蟲草菌粉中蟲草素含量，《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》2003版（簡稱《規(guī)范》）中的要求以蟲草為主要原料的保健食品中腺苷的測定用HPLC方法，用藥典或《規(guī)范》中的方法測定蟲草類制品中腺苷含量時結(jié)果偏低，上述方法均單一檢測蟲草中腺苷或蟲草素。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2116-2012可同時檢測蟲草中腺苷和蟲草素，但提取時間過長。近年來國內(nèi)采用高效液相色譜法測定蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量的報道較多，腺苷和蟲草素等核苷類成分是蟲草的主要功效成分，因此對這2種成分的檢測尤為重要。本研究目的是盡量簡化樣品前處理步驟，避免使用有毒有機(jī)溶劑，優(yōu)化HPLC方法，建立同時測定蟲草制品中腺苷和蟲草素的HPLC方法。

1材料與方法

1.1試驗時間、地點

研究室內(nèi)試驗在江蘇無錫進(jìn)行。

1.2儀器與試劑

戴安UltiMate3000高效液相色譜儀，UltiMate3000紫外檢測器，Chromeleon色譜工作站；KQ-100B超聲波清洗器，腺苷、蟲草素對照品（中國藥品生物制品檢定所），甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，試驗用水為二次蒸餾水。

1.3試驗方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取腺苷對照品0.0190g，用流動相溶解并定容至25mL容量瓶，稱取蟲草素對照品0.0160g用流動相溶解并定容至50mL容量瓶，分別配制成含腺苷0.76mg/mL和蟲草素0.32mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)液：分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于10mL容量瓶中，水定容至刻度，配制成含腺苷76μg/mL和蟲草素32μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度：將混合標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋分別配制成腺苷濃度為2.375、4.75、9.5、19、38μg/mL，蟲草素濃度為1、2、4、8、16μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2樣品的前處理 將蛹蟲草制品混和均勻，精確稱取樣品1.0g于50mL離心管中，加入25mL提取液后超聲提取，提取結(jié)束后用提取液定容至刻度，混勻后以10000vpm離心10min，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后供液相色譜分析用。

1.3.3色譜條件 色譜柱為C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）流動相：水-甲醇（85：15，V/V）；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量為20μL；柱溫30℃；檢測波長260nm。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇 中國藥典中用90%甲醇加熱回流提取，《規(guī)范》中用60%乙醇提取，農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中用水提取，筆者分別比較了同等處理條件下，水、60%乙醇、90%甲醇、100%乙醇5種溶劑提取效果，結(jié)果顯示以水提取效果最好，檢測結(jié)果見表1。

由表1可知，所測樣品中腺苷和蟲草素含量均隨提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低，用水提取的含量最高，這與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)使用的提取溶劑一致。

2.1.2提取時間的選擇 同一個樣品，用水作為提取劑，分別超聲提取10、40、80、180min，結(jié)果見表2。

由表2可知，在水做提取溶劑的條件下，提取時間短則提取不完全，超聲40min時蟲草素含量達(dá)到最大，隨著超聲時間延長提取效果沒有增加，所以提取時間定為40min。

2.2液相色譜條件的選擇

2.2.1流動相的選擇 中國藥典和《規(guī)范》中選用磷酸鹽溶液與甲醇的混合體系作為流動相，而長期使用鹽相會減少色譜柱的使用壽命，從而增加檢測成本。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中選用乙腈-水（5：95，V/V）作為流動相，考慮到乙腈的毒性較大，筆者采用不同比例的甲醇-水作為流動相，對腺苷和蟲草素的分離效果進(jìn)行比較，最終確定甲醇-水（15：85，V/V）為流動相，流速1.0mL/min，在此條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中腺苷和蟲草素能得到很好分離，色譜圖見圖1，樣品圖譜中腺苷和蟲草素的保留時間與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖一致，并且與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5。

2.2.2檢測波長的選擇 取腺苷和蟲草素對照品溶液在200-400mm進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)腺苷和蟲草素的最大吸收波長為260nm，因此確定檢測波長為260nm。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限 將標(biāo)準(zhǔn)系列依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為20μL，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行線性回歸，得腺苷標(biāo)準(zhǔn)系列（2.375～38μg/mL）的回歸方程為：Y=0.981X+0.2074，r=1；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)系列（1.00～32.0μg/mL）的回歸方程為：Y=0.9795X+0.0806，r=1。腺苷和蟲草素在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測定色譜峰達(dá)到3倍信噪比時，對應(yīng)的加標(biāo)濃度為檢出限；達(dá)到10倍信噪比時，對應(yīng)的加標(biāo)濃度為定量限。即本方法檢出限為0.2μg/mL，定量限1.0μg/mL。

2.3.2重復(fù)性試驗 取6份平行樣品，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果樣品中腺苷、蟲草素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為227、74.5mg/100g，RSD分別為1.12%和1.35%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗 樣品用水超聲提取40min后，分別放置0、4、8、12、24h后進(jìn)樣，測定腺苷、蟲草素的峰面積，結(jié)果腺苷、蟲草素的峰面積的RSD分別為2.12%和1.56%，表明試驗提取的溶液，腺苷和蟲草素的含量在24h內(nèi)保持相對穩(wěn)定。

2.3.4方法準(zhǔn)確度及精密度 取已知含量的3種蟲草制品，按照1.3.2章節(jié)下提到的方法處理，在1.3.3條件下測定，同時進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗，每個樣品每個添加水平取平行樣3份，計算方法回收率和精密度，結(jié)果見表3。加標(biāo)回收率在94%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。說明該方法加標(biāo)回收效果較好，適合于蟲草制品含量測定。

3討論

農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T2116-2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法可以很好地分離蟲草素和腺苷，但是需要用水超聲提取3h，耗時較長，本試驗對不同提取時間進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)提取40min后隨著超聲時間延長腺苷蟲草素含量沒有提高。

《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》2003版和中國藥典2010版冬蟲夏草項下腺苷含量測定，都采用磷酸鹽溶液與甲醇的混合體系作為流動相，作者比較幾種流動相分離效果，水-甲醇（85：15，V/V）作為流動相時樣品中腺苷和蟲草素的色譜峰分離度大于1.5，能夠得到很好地效果，同時此流動相避免磷酸鹽對色譜柱的損傷。本研究建立的液相色譜方法操作簡單，檢測結(jié)果穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高，適合于蟲草制品中腺苷和蟲草素定性定量分析。