李翠等

摘要：目的 探討半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)的配伍規(guī)律。方法 選取90只健康SD雄性大鼠，分為正常組10只和模型組80只。復(fù)制大鼠胃電節(jié)律失常模型，經(jīng)胃電生理學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)后，根據(jù)半夏瀉心湯的配伍特點(diǎn)，將其拆分為辛開、苦降、甘補(bǔ)、辛開苦降、辛開甘補(bǔ)、苦降甘補(bǔ)組，每組10只。各給藥組按相同藥物濃度不等體積連續(xù)灌胃4周。給藥后進(jìn)行胃電參數(shù)分析，采用免疫組化法、RT-PCR檢測(cè)胃組織Cx43及其mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組Cx43及其mRNA表達(dá)升高；與模型組比較，各給藥組胃電慢波頻率變異系數(shù)降低，各給藥組Cx43及其mRNA表達(dá)降低，其中辛開甘補(bǔ)組作用最為顯著。結(jié)論 半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)機(jī)制可能與其降低縫隙連接蛋白Cx43及其mRNA表達(dá)有關(guān)，從而改變紊亂的胃電節(jié)律，達(dá)到改善胃運(yùn)動(dòng)功能的作用。

關(guān)鍵詞：半夏瀉心湯；Cx43蛋白；縫隙連接；胃運(yùn)動(dòng)；大鼠

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）06-0075-05

胃腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂是大多胃腸道疾病的重要臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制，其發(fā)病率高。半夏瀉心湯出自《傷寒論》，具有降逆止嘔、消痞散結(jié)的作用。前期研究表明，半夏瀉心湯對(duì)胃電節(jié)律失常大鼠胃壁SCF基因表達(dá)水平、胃肌間神經(jīng)叢c-kit陽性間質(zhì)細(xì)胞（ICC）含量表達(dá)均有影響[1]。胃腸神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞（SMC）網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的變化對(duì)胃腸道動(dòng)力障礙性疾病有重要的病理生理學(xué)意義。在胃腸道中，縫隙連接（GJ）是介導(dǎo)SMC和ICC細(xì)胞間電化學(xué)信息交流，保證肌肉活動(dòng)的協(xié)調(diào)性和同步性的特殊通道。Cx43是構(gòu)成GJ最重要的連接蛋白，廣泛存在于胃腸Cajal與SMC之間。Cx43基因發(fā)生突變、數(shù)量減少，會(huì)影響細(xì)胞膜上GJ通道的數(shù)量，從而妨礙細(xì)胞間信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙。本研究以Cx43為切入點(diǎn)，根據(jù)半夏瀉心湯辛開苦降甘補(bǔ)的配伍特點(diǎn)，按照藥味特點(diǎn)與中醫(yī)病機(jī)結(jié)合分組的原則，采用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)研究半夏瀉心湯及其拆方對(duì)ICC細(xì)胞Cx43的影響，進(jìn)一步揭示半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制，闡釋經(jīng)方配伍規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康4周齡SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量（180±20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)0309256。所有動(dòng)物均給予大鼠全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物

半夏瀉心湯方的藥物劑量比例按文獻(xiàn)[2]換算。法半夏55.7 g，黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875 g，黃連15.62 g，大棗42 g。根據(jù)“法依病機(jī)，拆方依法”的研究思路[3]，將半夏瀉心湯拆分為辛開組（法半夏、干姜）、苦降組（黃芩、黃連）、甘補(bǔ)組（人參、炙甘草、大棗）、辛開苦降組（法半夏、干姜、黃芩、黃連）、辛開甘補(bǔ)組（法半夏、干姜，人參、炙甘草、大棗）及苦降甘補(bǔ)組（黃芩、黃連、人參、炙甘草、大棗）。所有藥物均為免煎顆粒，北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛，solarbio公司；免疫組化通用試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；一抗Connexin43 Antibody（鼠抗人，單克隆抗體）、二抗goat anti- mouse IgM-HRP，Santa cruz公司；Trizol，Invitrogen公司；氯仿，索萊寶公司；異丙醇，北京益奧明科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix，ABI公司；所有引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。多導(dǎo)生理儀EGG100C（BioPac公司，美國(guó)），SPOT software V3.0Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)（Diagnostic instruments，美國(guó)），LD5-2A離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司），超聲勻漿機(jī)（Pharmacia Biotech），紫外分光光度儀（Pharmacia，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀MX3000P（Stratagene，美國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組。正常組10只，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組80只，不規(guī)則喂養(yǎng)4周，即大鼠每逢單日正常進(jìn)食、雙日禁食，以打亂其正常的飲食節(jié)律。自由飲水，水中加入鹽酸（每升水加10 mol/L鹽酸10 mL），以破壞胃內(nèi)酸堿環(huán)境，制備大鼠胃電節(jié)律失常模型[4]。大鼠不規(guī)則喂養(yǎng)4周后，參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行胃電生理學(xué)評(píng)價(jià)，分析胃電慢波節(jié)律。模型大鼠胃電節(jié)律異常，胃動(dòng)過速、胃動(dòng)過緩和節(jié)律紊亂，與正常組比較有顯著差異，提示造模成功。將標(biāo)記好的80只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、辛開組、苦降組、甘補(bǔ)組、辛開苦降組、辛開甘補(bǔ)組、苦降甘補(bǔ)組、全方組，每組10只。相當(dāng)于人單位體質(zhì)量原藥材量的10倍，即得大鼠每日喂食用藥量。各給藥組每日按相同藥物濃度不等體積（5 mL/kg）給予相應(yīng)藥液灌胃，每日1次，連續(xù)4周。正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2 胃電生理學(xué)評(píng)價(jià)

給藥4周后，大鼠禁食18 h，腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，固定后腹部備皮，常規(guī)消毒，于劍突下正中切開腹壁1～2 cm，暴露胃竇部，在距幽門0.5 cm處漿膜下埋置一對(duì)Ag-AgCl電極，兩電極間距3 mm，還原暴露的胃組織，接地電極插入大鼠腿部肌肉處固定。將三股電極連接于多導(dǎo)生理儀上。打開Acqknowledge4.1，胃電橫軸時(shí)間以1 min為單位，縱軸振幅以2 mV為單位進(jìn)行胃電記錄，每次記錄30 min。胃電記錄完畢，用2/0縫合線縫合切口，碘伏擦拭。術(shù)后大鼠腹腔注射青霉素40萬U/（d·只），連續(xù)3 d。術(shù)后1周取材。胃電記錄以每10 min為1個(gè)時(shí)間段，計(jì)算每只大鼠每個(gè)時(shí)間段的慢波頻率以及每只大鼠慢波頻率變異系數(shù)[4]，進(jìn)行胃電參數(shù)分析。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃組織Cx43表達(dá)

大鼠禁食18 h后，3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，背位固定，取出胃組織，生理鹽水沖洗干凈后，4%多聚甲醛固定。采用SABC免疫組化檢測(cè)法胃組織Cx43表達(dá)，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用SPOT software V3.0Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)，將染色后的病理切片在10倍光鏡下觀察后，在40倍鏡下每例標(biāo)本隨機(jī)選擇肌間神經(jīng)叢的5個(gè)最能反映胃壁全貌的視野，觀察Cx43表達(dá)分布情況，結(jié)果進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)平均光密度值，計(jì)算積分光密度值（IOD）。以細(xì)胞質(zhì)有明確棕色或棕黃色著色而細(xì)胞核無著色為陽性表達(dá)。

2.4 RT-PCR檢測(cè)大鼠胃壁Cx43基因表達(dá)

取胃組織30 mg，置于冰上，加Trizol勻漿，按照常規(guī)操作順序提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260和OD280，計(jì)算總RNA的濃度及純度。取2 μg總RNA，在鳥類成髓細(xì)胞瘤反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）和Oligo（dT）條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，70 ℃×10 min，4 ℃×5 min，42 ℃×30 min，95 ℃×5 min，4 ℃×5 min，獲得cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，含2 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各1 μL，5×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL。

根據(jù)文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)引物。Cx43引物序列：上游5'-ACTTCAGCCTCCAAGGAGTTC-3'，下游5'-CATGTCTGG GCACCTCTCTTT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度80 bp；以GAPDH作為內(nèi)參照。上游5'-GCTCTCTGCTCCTCC CTGTTCTAGA-3'，下游5'-CCGTTCACACCGACCTTCACCAT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度95 bp。2條引物擴(kuò)增效率均為90%～100%。GAPDH、Cx43擴(kuò)增條件為：95 ℃×5 min預(yù)變性；95 ℃×30 s，55 ℃×30 s，72 ℃×30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃×1 min，55 ℃×30 s，95 ℃×30 s，1個(gè)循環(huán)。

每個(gè)樣品設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，取均值。將所得Ct值按照2-ΔΔCt的方法進(jìn)行均一化處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用—x±s表示，所有數(shù)據(jù)剔除隨機(jī)誤差及人為因素導(dǎo)致的過高或過低的測(cè)量值，隨后進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)K個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；服從正態(tài)分布時(shí)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)；各給藥組與模型組比較采用Dunnett's T3檢驗(yàn)；各給藥組之間兩兩比較采用Tukey's Multiple Comparison Test檢驗(yàn)；各給藥組之間是否有交互作用采用析因分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 半夏瀉心湯及其拆方對(duì)大鼠胃電慢波頻率變異系數(shù)的影響

如圖1所示，正常組大鼠胃電節(jié)律正常，模型組大鼠胃電節(jié)律異常，胃動(dòng)過速或過緩，節(jié)律紊亂。模型組大鼠胃電慢波頻率變異系數(shù)最大，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各給藥組胃電節(jié)律均有不同程度改善，胃電慢波頻率變異系數(shù)低于模型組，各組慢波頻率變異系數(shù)為辛開苦降組<辛開甘補(bǔ)組<全方組<甘補(bǔ)組<苦降甘補(bǔ)組<苦降組<辛開組<模型組，但僅全方組、甘補(bǔ)組、辛開苦降組、辛開甘補(bǔ)組與之比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見表1。提示半夏瀉心湯及其拆方各組具有不同程度糾正胃電節(jié)律失常的作用。

4.2 半夏瀉心湯及其拆方對(duì)大鼠胃組織Cx43表達(dá)的影響

Cx43陽性表達(dá)為環(huán)形肌層間夾雜的深淺不同的棕黃色著色，Cx43陽性表達(dá)水平用IOD表示，IOD值越高其陽性表達(dá)水平越高，即Cx43蛋白含量越高。與正常組比較，模型組、各給藥組Cx43的棕黃色陽性表達(dá)增高，Cx43 IOD值增高，其中模型組肌間神經(jīng)叢Cx43陽性表達(dá)最為密集，且圖片顯示分布不均勻，并以環(huán)形肌之間為多，模型組陽性表達(dá)IOD值顯著增高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組Cx43的棕黃色陽性表達(dá)降低，Cx43 IOD值降低。各給藥組中，辛開甘補(bǔ)組Cx43表達(dá)顯著降低，散在分布于肌層間。各組胃組織Cx43陽性表達(dá)排序?yàn)椋盒灵_甘補(bǔ)組<甘補(bǔ)組<辛開苦降組<辛開組<全方組<苦降甘補(bǔ)組<苦降組<模型組。見表2、圖2。

4.3 半夏瀉心湯及其拆方對(duì)大鼠胃組織Cx43 mRNA表達(dá)的影響

模型組大鼠胃組織Cx43 mRNA表達(dá)明顯高于正常組（P<0.05）；各給藥組Cx43 mRNA表達(dá)均低于模型組（P<0.001），其中苦降組、甘補(bǔ)組、辛開苦降組、全方組、辛開甘補(bǔ)組、苦降甘補(bǔ)組與之比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。析因分析結(jié)果顯示，各給藥組間無明顯差異，甘補(bǔ)組在全方配伍中起主要作用，各給藥組間不存在交互作用。見表3。

5 討論

胃運(yùn)動(dòng)功能障礙可歸屬于中醫(yī)“痞證”范疇，半夏瀉心湯為治療痞證的經(jīng)典方，研究其調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制對(duì)進(jìn)一步闡明胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙機(jī)制具有重要意義。對(duì)胃電節(jié)律失常引起的胃運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)，半夏瀉心湯及其拆方是否有調(diào)節(jié)作用及其相應(yīng)作用機(jī)制，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)研究。胃電節(jié)律的改變與Cajal間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的減少或增加密切相關(guān)，胃壁Cajal數(shù)量表達(dá)是否正常對(duì)調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要。ICC、胃腸神經(jīng)以及SMC間可形成網(wǎng)絡(luò)狀連接。胃腸神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)是胃腸動(dòng)力的基本功能單位，可以傳導(dǎo)電興奮，介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)，對(duì)揭示多種胃腸道功能障礙性疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要作用，這種細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)即通過GJ實(shí)現(xiàn)。

Cx43是構(gòu)成GJ最重要的連接蛋白，與胃腸運(yùn)動(dòng)有密切關(guān)系。修復(fù)ICC和促進(jìn)ICC的再生能夠上調(diào)Cx43蛋白的表達(dá)，增加神經(jīng)纖維的數(shù)目，從而保持胃腸神經(jīng)-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整，恢復(fù)胃腸動(dòng)力[6]。有研究表明，糖尿病胃輕癱大鼠胃縱肌層內(nèi)ICC分布減少，環(huán)形肌內(nèi)Cx43的表達(dá)下降，而補(bǔ)充胰島素可逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠ICC、Cx43病變從而改善胃動(dòng)力障礙[7]，提示Cx43表達(dá)增高對(duì)胃運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)作用。因此，通過探究Cx43在胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病中的作用機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步揭示半夏瀉心湯治療胃電節(jié)律紊亂的作用機(jī)制，探究經(jīng)方配伍規(guī)律意義較大。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組與正常組比較慢波頻率變異系數(shù)顯著增高，各給藥組與模型組比較慢波頻率變異系數(shù)有不同程度降低，提示半夏瀉心湯及其各拆方組具有調(diào)節(jié)胃電節(jié)律的作用。電節(jié)律紊亂的模型組其Cx43在胃組織上的分布表達(dá)顯著高于正常組，且分布不均勻，提示胃電節(jié)律紊亂引起的胃動(dòng)過速可能與Cx43異常增高表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)。半定量分析結(jié)果顯示，各給藥組均對(duì)Cx43表達(dá)量有不同程度降低作用，辛開甘補(bǔ)組Cx43陽性表達(dá)顯著降低。各給藥組與模型組比較，Cx43陽性表達(dá)均有不同程度的降低，提示各給藥組對(duì)胃組織縫隙連接Cx43的表達(dá)分布均具有不同程度降低作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，半夏瀉心湯及其拆方干預(yù)可以影響Cx43 mRNA的表達(dá)，各給藥組都可以有效降低胃組織Cx43 mRNA的異常增高表達(dá)，其中苦降甘補(bǔ)組對(duì)Cx43 mRNA的抑制最顯著，提示半夏瀉心湯組方抑制Cx43 mRNA表達(dá)，主要通過苦降藥物與甘補(bǔ)藥物的協(xié)同配伍來實(shí)現(xiàn)。相關(guān)研究表明，采用苦寒瀉下法建立的大鼠脾氣虛模型，胃肌層Cx43表達(dá)降低[8]，也提示苦瀉藥物對(duì)Cx43的表達(dá)有抑制作用。綜合上述結(jié)果，模型組慢波頻率變異系數(shù)增高，Cx43表達(dá)增強(qiáng)，基于Cx43表達(dá)增高對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)作用。因此，我們推測(cè)Cx43表達(dá)異常增高會(huì)誘導(dǎo)胃電節(jié)律紊亂引起胃動(dòng)過速，從而導(dǎo)致胃運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)。半夏瀉心湯通過辛開、苦降、甘補(bǔ)藥物協(xié)同配伍作用從而降低Cx43的表達(dá)。由此我們推測(cè)半夏瀉心湯方不僅能治療胃動(dòng)過緩導(dǎo)致胃運(yùn)動(dòng)功能障礙的心下痞證，還能通過抑制Cx43過表達(dá)有效抑制胃電節(jié)律紊亂引起的胃動(dòng)過速，從而改善胃運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)癥狀，對(duì)胃運(yùn)動(dòng)功能起雙向調(diào)節(jié)的作用。各拆方組間協(xié)同作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2015-01-07）

（修回日期：2015-02-05；編輯：華強(qiáng)）