楊欣 王秋紅 王悅 郭慧 邢娜 匡海學

摘要：目的 采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術鑒別不同地區(qū)板藍根，為板藍根藥材的鑒別和質量評價提供依據(jù)。方法 采用SDS-PAGE技術，建立黑龍江和河北地區(qū)板藍根蛋白圖譜。結果 黑龍江板藍根蛋白約含13條亞基，主要為10.5 kD、23.0 kD、24.9 kD、44.1 kD 4種亞基，河北板藍根蛋白約含12條亞基，主要為55.6 kD、45.9 kD、34.3 kD、18.9 kD、12.4 kD、10.5 kD 6種亞基。結論 SDS-PAGE技術可以用于鑒別不同地區(qū)的板藍根。

關鍵詞：板藍根；鑒別；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.024

中圖分類號：R282.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0086-03

Analysis on Isatidis Radix Protein in Different Areas by SDS-PAGE YANG Xin， WANG Qiu-hong， WANG Yue， GUO Hui， XING Na， KUANG Hai-xue （Key Laboratory of Basic and Appilication Research of Chinese Medicine， Ministry of Education；Heilongjiang Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacodynamic Material Bases；Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To identify Isatidis Radix in different areas by SDS-PAGE；To provide the basis for the identification and quality evaluation of Isatidis Radix. Methods By using SDS-PAGE technology， the protein profiles of Isatidis Radix in Heilongjiang and Hebei regions were established. Results Isatidis Radix protein in Heilongjiang contained about 13 protein subunits， and the major subunits were 10.5 kD， 23.0 kD， 24.9 kD， and 44.1 kD. Isatidis Radix protein in Hebei contained about 12 subunits， and the major subunits were 55.6 kD， 45.9 kD， 34.3 kD， 18.9 kD， 12.4 kD， and 10.5 kD. Conclusion SDS-PAGE technology can be used as one of the references to identify Isatidis Radix in different areas.

Key words：Isatidis Radix；identify；SDS-PAGE

《中華人民共和國藥典》規(guī)定，正品板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根[1]，主要功效為涼血消腫、清熱解毒，研究表明其有抗內毒素的作用[2-3]。由于板藍根用途非常廣泛，產(chǎn)量與市場的供求矛盾使其鑒別和質量受到高度關注。目前中藥成分研究主要集中在生物堿、多糖等方面，而對蛋白質等大分子的研究較少。本試驗對不同地區(qū)的板藍根蛋白質分子進行指紋圖譜研究，以提供不同地區(qū)板藍根藥材的更多信息，為其質量控制及進一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

UV-1700紫外分光光度計，日本島津；電泳儀和電泳自動成像儀，美國BIO-RAD生化科技有限公司；電

通訊作者：匡海學，E-mail：hxkuang56@163.com

子天平，上海人和科學儀器有限公司；MIKRO220R離心機，德國Hettich。

板藍根樣本采自黑龍江和河北地區(qū)，每個地區(qū)隨機采集10個樣本，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定符合2010年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，用硅膠干燥，室溫保存。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑，BIO-RAD生化科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 蛋白提取

采用植物蛋白提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW2033）進行蛋白提取，所提蛋白可直接進行蛋白電泳分析。①取0.1 g板藍根，用液氮研磨成細末，轉入離心管中。②取990 μL蛋白抽提試劑，在進行蛋白抽提前2～3 min加入10 μL蛋白酶抑制劑。③加入配好的組織蛋白抽提試劑。④冰上孵育20～30 min。⑤10 000×g離心20 min。⑥收集上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 蛋白定量檢測和標準曲線繪制

采用二喹啉甲酸（bicin-choninic acid，BCA）蛋白定量法[4-5]。紫外分光光度儀開機預熱20 min。取7只滅菌后的試管（編號1～7），按表1對標準品進行稀釋，將稀釋好的標準品牛血清白蛋白（BSA）和待測蛋白樣品各100 μL分別加入做好標記的試管1～7中，每個樣本做3個平行反應。向每個試管中各加入2 mL BCA工作液，充分混勻，室溫孵育2 h。將各管冷卻至室溫。用分光光度計在562 nm處測定樣品及BSA的吸光值，分別讀取1～7號管的光密度。以蛋白濃度（μg/μL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，用Excel繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白含量。

表1 標準品的稀釋

管號 BSA（μg） 0.9%氯化鈉溶液（μg） 稀釋后BSA（μg/μL）

1 100 0 2

2 200 200 1

3 200 200 0.5

4 200 200 0.25

5 200 200 0.125

6 200 200 0.062 5

7 0 200 0

2.3 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白完整性

采用雙垂直板SDS-PAGE進行分析[6-8]。分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，凝膠厚度為1 mm，考馬斯亮藍快速染色（G250）方法進行凝膠染色，染色后的凝膠用 BIO-RAD掃描儀進行掃描，重復3次，并采用Image Lab 4.0.1軟件進行圖像分析。

3 結果

3.1 標準曲線

為了提高試驗的準確性，減少不必要的誤差，將1～7號試管在562 nm比色測定3次，求平均值，結果見表2。

表2 比色測定結果

管號 濃度（μg/μL） 吸光值

1 0 0

2 0.062 5 0.022 4

3 0.125 0 0.050 7

4 0.250 0 0.115 3

5 0.500 0 0.207 6

6 1.000 0 0.422 6

7 2.000 0 0.795 7

3.2 板藍根的蛋白含量

將10個隨機樣品提取的蛋白進行混合，采用BCA蛋白定量方法測得河北和黑龍江地區(qū)板藍根蛋白含量分別為1.594、2.613 μg/μL。

3.3 蛋白的完整性分析

黑龍江和河北地區(qū)板藍根蛋白亞基分布見圖1、圖2。染色后板藍根蛋白質條帶清晰，沒有拖尾現(xiàn)象，條帶顏色越深說明蛋白含量越高，顏色越淺說明蛋白含量越低。從板藍根蛋白SDS-PAGE圖及其亞基分布譜圖可以看出，黑龍江板藍根所含亞基數(shù)約為13條，亞基的分子質量范圍為10.5～174 kD，其中，黑龍江板藍根蛋白亞基的最大分子質量為174 kD，最小為10.5 kD，亞基7、9、10、13含量最高。河北板藍根所含亞基數(shù)約為12條，亞基分子質量范圍為10.5～173.3 kD，其中，河北板藍根蛋白亞基的最大分子質量為173.3 kD，最小的為10.5 kD，亞基5、6、7、10、11、12含量最高。蛋白泳道和條帶分析見表3～表6?？梢?，不同地區(qū)板藍根蛋白SDS-PAGE分離效果良好，分辨率高、條帶清晰、數(shù)量較多，蛋白條帶具有多態(tài)性，2個地區(qū)的板藍根有相似條帶，也有特征條帶。

圖1 黑龍江地區(qū)板藍根蛋白電泳圖譜

圖2 河北地區(qū)板藍根蛋白電泳圖譜

表3 黑龍江地區(qū)板藍根標準蛋白泳道和條帶分析

條帶編號 分子量（kD） 相對前沿 體積（lnt） 條帶百分比（%） 泳道百分比（%）

1 175.0 0.023 22 022 364 21.6 16.6

2 130.0 0.113 3 491 504 3.4 2.6

3 95.0 0.158 4 935 421 4.8 3.7

4 70.0 0.227 5 134 009 5.0 3.9

5 62.0 0.302 5 500 298 5.4 4.1

6 51.0 0.373 5 208 178 5.1 3.9

7 42.0 0.446 6 001 257 5.9 4.5

8 29.0 0.531 6 305 169 6.2 4.7

9 22.0 0.715 7 693 074 7.5 5.8

10 14.0 0.892 5 876 570 5.8 4.4

11 10.5 0.983 29 813 191 29.2 22.5

表4 黑龍江地區(qū)板藍根蛋白泳道和條帶分析

條帶編號 分子量（kD） 相對前沿 體積（lnt） 條帶百分比（%） 泳道百分比（%）

1 174.0 0.025 24 160 535 24.7 18.1

2 131.0 0.113 137 551 0.1 0.1

3 76.9 0.206 231 887 0.2 0.2

4 66.5 0.259 230 681 0.2 0.2

5 63.7 0.285 334 263 0.3 0.3

6 56.1 0.338 1 037 026 1.1 0.8

7 44.1 0.428 8 150 014 8.3 6.1

8 27.2 0.574 667 722 0.7 0.5

9 24.9 0.632 3 694 112 3.8 2.8

10 23.0 0.687 4 029 782 4.1 3.0

11 15.2 0.859 1 505 624 1.5 1.1

12 13.9 0.894 370 510 0.4 0.3

13 10.5 0.978 53 374 947 54.5 40.0

表5 河北地區(qū)板藍根標準蛋白泳道和條帶分析

條帶編號 分子量（kD） 相對前沿 體積（lnt） 條帶百分比（%） 泳道百分比（%）

1 175.0 0.018 4 219 390 4.4 4.0

2 130.0 0.108 4 061 943 4.2 3.9

3 95.0 0.157 5 697 243 5.9 5.4

4 70.0 0.226 6 982 415 7.3 6.6

5 62.0 0.303 7 892 021 8.2 7.5

6 51.0 0.372 6 400 264 6.7 6.1

7 42.0 0.447 7 513 453 7.8 7.2

8 29.0 0.530 7 327 250 7.6 7.0

9 22.0 0.718 8 925 736 9.3 8.5

10 14.0 0.892 8 137 079 8.5 7.7

11 10.5 0.979 28 744 703 30.0 27.4

表6 河北地區(qū)板藍根蛋白泳道和條帶分析

條帶編號 分子量（kD） 相對前沿 體積（lnt） 條帶百分比（%） 泳道百分比（%）

1 173.3 0.021 5 739 360 9.4 7.1

2 79.5 0.198 164 560 0.3 0.2

3 66.1 0.262 3 169 520 5.2 3.9

4 62.6 0.296 906 960 1.5 1.1

5 55.6 0.341 2 963 200 4.8 3.7

6 45.9 0.413 2 965 200 4.4 3.3

7 34.3 0.493 2 194 080 3.6 2.7

8 26.2 0.599 1 259 760 2.1 1.6

9 23.6 0.671 710 640 1.2 0.9

10 18.9 0.777 3 338 640 5.4 4.1

11 12.4 0.930 8 210 160 13.4 10.1

12 10.5 0.990 29 965 520 48.9 37.0

4 小結

本研究采用雙垂直板SDS-PAGE技術對不同地區(qū)板藍根進行研究和分析，該技術具有操作簡單、結果可靠、重現(xiàn)性好、樣品量少、價格便宜等優(yōu)點。該技術可以通過比較蛋白圖譜，根據(jù)蛋白圖譜上的蛋白條帶數(shù)量、分子量大小、條帶顏色深淺等對不同地區(qū)、不同品種的藥材進行鑒別和質量研究。黑龍江地區(qū)板藍根是移栽品種，不同地域土壤酸堿度對植物種植和生長及土壤肥力都有一定影響。本試驗為板藍根藥材種植、質量評價，以及進一步深入研究提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2014-11-05）

（修回日期：2014-12-26；編輯：陳靜）