李 源 劉 穎 袁海峰 馬新欣 張 欣 李 明 侯吉星 權(quán)乾坤 李 璽

(西安電力中心醫(yī)院，陜西 西安 710032)

阿爾茨海默病(AD)病理改變主要包括老年斑(SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和神經(jīng)元丟失等〔1～3〕。tau蛋白異常磷酸化是導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)發(fā)生的原因之一。神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的含量會隨著年齡的增加而下降，而老年癡呆患者下降更為嚴重〔4〕。因此，膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性也反映了膽堿能神經(jīng)元的活性和AD的嚴重程度。人參皂苷Rg1是人參皂苷中最主要的成分之一，具有促進海馬神經(jīng)發(fā)生、提高神經(jīng)可塑性、增強學(xué)習(xí)、記憶力等作用〔5〕，提示Rg1對AD治療有著重要的潛在價值。但目前，關(guān)于人參皂苷Rg1對磷酸化tau(P-tau)蛋白及ChAT的影響國內(nèi)外均未見研究報道。本研究以岡田軟海綿酸(OA)誘導(dǎo)大鼠腦片tau蛋白過度磷酸化制備AD模型，觀察人參皂苷Rg1對P-tau蛋白、ChAT的表達的影響，旨在闡明人參皂苷Rg1抗癡呆的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠10只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，清潔級，鼠齡:5 w;體重:110～130 g;合格證號為SCXK(陜)2007-001。

1.2 藥品及試劑 人參皂苷Rg1，純度98.99%，吉林宏久生物科技股份有限公司產(chǎn)品;OA，純度98%，美國ALEXIS生物制劑公司產(chǎn)品;P-tau(Sere202)一抗ChAT一抗，辣根酶標記二抗，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;PVDF膜及DAB染色試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.3 儀器 振動切片機(上海之信儀器有限公司，型號:ZQP-86);紫外分光光度儀(日本島津，型號:UV-260);蛋白電泳儀(美國BIO-RAD，型號:迷你型-3);凝膠成像圖像分析儀〔意大利 Segrate(Milan)〕。

1.4 方法

1.4.1 AD模型大鼠腦片模型的制備、分組及干預(yù) 將大鼠麻醉，快速斷頭，取出腦組織，行冠狀切片，取海馬及皮層腦片置入盛有人工腦脊液的6孔板中培養(yǎng)。整個過程持續(xù)通入混合氧氣(95%O2+5%CO2)，溫度始終保持低于4℃。每只大鼠平均取400μm厚海馬及皮層腦片5張，隨機分為五組:空白對照組、模型組、人參皂苷Rg1高、中、低濃度組。各組腦片首先至于人工腦脊液中不做任何處理恢復(fù)1 h;然后Rg1高、中、低濃度組分別加入Rg1致使其終濃度為240、120、60μmol/L，培養(yǎng)至2 h;然后將OA加入模型組和人參皂苷R1各組中，致使其終濃度分別為1μmol/L，作用3 h，空白對照組不加任何處理。

1.4.2 Western印跡 干預(yù)結(jié)束后，將腦片取出勻漿，充分裂解后離心分離，定量分裝。采用不連續(xù)SDS-PAGE法，將提出的總蛋白經(jīng)電泳儀電泳在分離膠上展開、轉(zhuǎn)膜/印，經(jīng)多次封閉、漂洗后，用待測目的蛋白的一抗(P-tau抗體濃度200μg/ml、ChAT抗體濃度200μg/ml)與PVDF膜上的蛋白質(zhì)相互作用，再與辣根酶標記的ChAT、P-tau第二抗體作用。采用DAB法顯色，用PBS做陰性對照。

1.4.3 圖像分析與檢測 通過二抗上的標記酶與底物的反應(yīng)呈色，用凝膠成像分析儀對各組蛋白條帶表達情況進行灰度值掃描分析，分別檢測各組P-tau、ChAT陽性表達的情況，然后以各組條帶所測平均灰度值與β-actin的灰度值的比值，表示該組陽性物質(zhì)的表達量，采集10組數(shù)據(jù)，求均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用x±s表示，使用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析法及LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片P-tau表達的影響與空白對照組比較，模型組P-tau表達顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較，人參皂苷Rg1各濃度組P-tau表達均顯著減少(P＜0.01)，其中高濃度組P-tau表達減少最為明顯，其次為中、低濃度組。見表1、圖1。

2.2 人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片ChAT表達的影響 與空白對照組比較，模型組ChAT表達顯著減少(P＜0.01)。人參皂苷Rg1各濃度組與模型組比較，ChAT表達均顯著增加(P＜0.01);高濃度組較中濃度組ChAT表達增加更為顯著(P＜0.01)，中濃度組較低濃度組表達增加(P＜0.01)。見表1、圖2。

表1 人參皂苷Rg1對AD大鼠腦片P-tau、ChAT表達的影響(x ± s，n=10)

圖1 各組大鼠腦片P-tau的表達

圖2 各組大鼠腦片ChAT的表達

3 討論

AD即老年性癡呆是以進行性記憶和認知功能喪失為臨床特征的大腦退行性疾病。研究提示，Tau蛋白異常磷酸化在AD患者神經(jīng)變性和學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔6，7〕。OA是一種海洋生物提取物，研究證實，在體內(nèi)或體外條件下，OA可通過聯(lián)結(jié)催化亞單位以及甲基化抑制磷酸酯酶活性并引發(fā)tau蛋白異常的磷酸化這一AD關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔8〕，而tau蛋白異常磷酸化會使其結(jié)合組裝微管的生物學(xué)功能降低，進而致微管解聚。由于微管在神經(jīng)細胞的軸漿運輸、極性維持等生理活動中具有重要作用，所以，tau蛋白過度磷酸化會嚴重阻礙細胞的正常生理功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞退化，產(chǎn)生或加重AD病情〔9〕。AD患者腦中ChAT的活性反映了膽堿能神經(jīng)元的活性和病情的嚴重程度。本實驗結(jié)果表明，OA處理的模型組大鼠ChAT陽性表達數(shù)量顯著減低?？紤]這一機制可能正是由于OA使海馬及皮層神經(jīng)元中tau蛋白過度磷酸化，影響了啟動微管組裝的微管蛋白-β亞單位與GTP結(jié)合的反應(yīng)，降低了微管組裝能力，損害了軸漿流，致使胞體和神經(jīng)末梢之間的營養(yǎng)物質(zhì)和遞質(zhì)的運輸受到影響，使ChAT不能運輸?shù)胶ｑR及皮層，導(dǎo)致AD模型大鼠腦片產(chǎn)生ChAT陽性表達數(shù)量顯著減低的變化，最終影響到海馬和皮層神經(jīng)元的形態(tài)和功能。

人參皂苷被認為是人參的主要有效物質(zhì)，約占4%。根據(jù)皂苷元的不同，人參皂苷被分為原人參二醇類皂苷、原人參三醇類皂苷及齊墩果酸類皂苷。到目前為止，已分離鑒定出40余種人參皂苷單體。近年來，人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1等單體治療AD的研究已獲得一定的突破〔10〕，其中，人參皂苷Rg1的相關(guān)研究已經(jīng)顯示出對AD的預(yù)防和治療有一定的作用〔11，12〕。但其機制有待進一步探討。

本實驗結(jié)果證實人參皂苷Rg1可以減少AD模型大鼠腦片P-tau的表達，同時增加膽堿能系統(tǒng)中乙酰膽堿的合成和釋放，增強腦突觸受體對膽堿的提取，提高大鼠ChAT的活性發(fā)揮抗AD的作用。并發(fā)現(xiàn)該作用具有明顯的劑量依賴性。考慮其可能的機制是人參皂苷Rg1對抗了OA選擇性抑制蛋白磷酸酯酶這一作用，保持了蛋白激酶和磷酸酯酶的動態(tài)平衡，使得tau蛋白異常磷酸化的數(shù)量減少，確保微管組裝能力不受損害，進而保障了膽堿能系統(tǒng)中Ach的合成和釋放，維持腦中ChAT的正常水平。總之，人參皂苷Rg1可能通過抑制Tau蛋白磷酸化及促進ChAT的表達，從而發(fā)揮抗癡呆作用。

1 柄澤昭秀.癡呆的流行病學(xué)〔J〕．日本醫(yī)學(xué)介紹，2005;26(3):97-100.

2 Blennow K，de Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimers disease〔J〕．Lancet，2006;368(9533):387-403.

3 金 環(huán)，黃河勝，查向東，等.阿爾茨海默病的發(fā)病機制、早期診斷及治療的新策略〔J〕．中國藥理學(xué)通報，2007;23(7):847-97.

4 Lawrence AD，Sahakian BJ.The cognitive psychopharmacology of Alzheimer＇s disease:focus on cholinergic systems〔J〕．Neurochem Res，1998;23(5):787-94.

5 張均田.人參冠百草〔M〕．第2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2012:95-103，117-27，131-51，222-8，293-305.

6 王建枝，田 青.Tau蛋白過度磷酸化機制及其在阿爾茨海默病神經(jīng)元變性中的作用〔J〕．生物化學(xué)與生物物理進展，2012;39(8):771-7.

7 劉 穎，李 璽，袁海峰.人參皂苷Rg1促進學(xué)習(xí)記憶作用研究進展〔J〕．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006;26(10):956-60.

8 Baig S，van Helmond Z，Love S.Tau hyperphosphorylation affects Smad 2/3 translocati-on〔J〕．Neuroscience，2009;163(2):561-70.

9 Yoon S，Choi J，Haam J，et al.Reduction of mint-1，mint-2，and APPover expression in Okadaic acid-treated neurons〔J〕．Neuro Report，2007;18(18):1879-83.

10 石楸鳴.人參皂苷的藥理作用研究進展〔J〕．中國藥理學(xué)雜志，2010;21(31):2967-8.

11 Wang YH，Du Gh.Ginsenoside Rg1 inhibits beta-secretase activity in vitro and protects against A beta-induced cytotoxicity in PC12 cells〔J〕．JAsian Nat Prod Res，2009;11(7):604.

12 Shi YQ，Huang TW，Chen LM，et al.Ginsenoside Rg1attenuates amyloidbeta content，regulates PKA/CREB ac-tivity，and improves cognitive performance in SAMP8 mice〔J〕．JAlzheimers Dis，2010;19(3):977.