張 萌 彭 利 喬治斌 何洪濤 周 燁 梁占強(qiáng) 徐 卓

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011)

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)與惡性腫瘤的關(guān)系及其配體的治療作用正受到廣泛的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ配體具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成及降低腫瘤侵襲力等作用，此類作用與PPAR-γ激活后參與調(diào)控多條細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路有關(guān)〔1〕。P38MAPK通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的重要成員，受細(xì)胞外信號的刺激而激活，通過磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡〔2〕。有研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ激活后可經(jīng)P38MAPK通路誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡〔3〕，但二者在肝細(xì)胞癌的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法檢測肝癌組織及正常肝組織中PPAR-γ和P38MAPK蛋白的表達(dá)，分析其與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系及相互關(guān)系，探討其在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的意義及其預(yù)后價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科2007年1月至2010年3月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的隨訪資料完整的肝細(xì)胞癌標(biāo)本57例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)過任何抗腫瘤治療。其中男51例，女6例，年齡34～75歲，中位年齡57歲。標(biāo)本切除離體立即固定于10%中性甲醛溶液，石蠟包埋。57例肝細(xì)胞癌組織中，27例直徑≤5 cm，30例直徑＞5 cm;侵及鄰近臟器或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共11例，未侵及鄰近臟器或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例;有門靜脈瘤栓7例，無門靜脈瘤栓50例;47例為單發(fā)腫瘤，10例為肝內(nèi)多發(fā)腫瘤。臨床分期根據(jù)TNM分期，Ⅰ期1例，Ⅱ期23例，Ⅲ期32例，Ⅳ期1例。另取肝血管瘤患者之肝組織20例作為對照。由兩位有經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)師進(jìn)行病理組織學(xué)診斷。

1.2 主要試劑 PPAR-γ(E-8)鼠抗人單克隆抗體及P38MAPK(H-147)兔抗人單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。即用型非生物素免疫組化EliVisionTMsuper檢測試劑盒(KIT-9922)、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2試劑盒(KIT-5920)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 采用免疫組織化學(xué)一步法(EliVisionTMsuper試劑盒)檢測標(biāo)本。切片均用2%APES處理，4μm連續(xù)切片。橘櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)。PPAR-γ和P38MAPK抗體均以1∶100稀釋。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照;PPAR-γ的陽性對照為已知陽性的乳腺癌切片;P38MAPK的陽性對照為已知陽性的胰腺癌切片。

1.4 結(jié)果判定 PPAR-γ蛋白陽性染色集中于細(xì)胞核，少數(shù)為胞核、胞質(zhì)均著色，呈棕黃色至深棕色粗顆粒狀。參照文獻(xiàn)〔4〕判定標(biāo)準(zhǔn)，陽性細(xì)胞所占比例＜10%者為陰性，陽性細(xì)胞所占比例≥10%者為陽性。P38MAPK蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。根據(jù)文獻(xiàn)〔5〕綜合細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占百分率進(jìn)行評分，每張切片細(xì)胞的著色程度得分和著色細(xì)胞的百分率得分相乘，即為陽性系數(shù)。陽性系數(shù)≤2分為低表達(dá)，陽性系數(shù)＞2為高表達(dá)。

1.5 隨訪情況 隨訪所有病例均有完整隨訪資料，研究自手術(shù)之日起，至本研究結(jié)束(2013-1-1)止，隨訪時間單位為月，研究終點(diǎn)(陽性結(jié)局)定義為患者因肝癌或相應(yīng)并發(fā)癥死亡，研究結(jié)束時仍未出現(xiàn)陽性結(jié)局者定為刪失。隨訪時間1.0～71.1個月，中位隨訪時間為27.2個月。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率計算法;相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線，并經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PPAR-γ蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 PPAR-γ蛋白在57例肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率(45.6%)顯著高于正常肝組織(15.0%)(P＜0.05，見圖1)。PPAR-γ蛋白在門靜脈癌栓組的陽性表達(dá)率顯著高于無門靜脈癌栓組(P＜0.05);PPAR-γ蛋白的陽性表達(dá)率在TNM分期各組之間差異顯著，分期越晚陽性率越高(P＜0.05)。PPAR-γ蛋白表達(dá)在患者年齡、性別、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、有否轉(zhuǎn)移各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

PPAR-γ蛋白陽性表達(dá)組的 1、3、5年生存率分別為53.8%、42.3%、0.0%;陰性表達(dá)組的1、3、5年生存率分別為54.8%、48.4%、39.9%;兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 P38MAPK蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 57例肝細(xì)胞癌組織中P38MAPK蛋白的高表達(dá)率為64.9%，顯著高于正常肝組織(14.3%，P＜0.05，見圖1)。但P38MAPK蛋白高表達(dá)在患者年齡、性別、門靜脈癌栓、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、TNM分期、有否轉(zhuǎn)移各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，表1)。

P38MAPK蛋白高表達(dá)組的 1、3、5年生存率分別為67.7%、45.5%、43.1%;低表達(dá)組的 1、3、5 年生存率分別為42.5%、39.2%、0%;兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 PPAR-γ與P38MAPK蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 PPAR-γ與P38MAPK蛋白在不同組織中的表達(dá) (IHC，×200)

2.3 PPAR-γ和P38MAPK蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)相關(guān)性 在肝細(xì)胞癌組織中PPAR-γ蛋白與P38MAPK蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.378，P=0.004)。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。在胃癌組織中，PPAR-γ表達(dá)顯著高于胃黏膜異型增生及慢性萎縮性胃炎，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度無關(guān)，提示PPAR-γ 的高表達(dá)是胃癌發(fā)生的早期事件之一〔4〕;Wang等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ表達(dá)上調(diào)在正常食管組織向巴雷特食管和食管癌發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PPAR-γ蛋白的陽性表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，PPAR-γ蛋白有可能為患者的不良預(yù)后提供參考;但是經(jīng)Kaplan-Meier生存分析顯示PPAR-γ蛋白的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后無關(guān)，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量或延長隨訪時間有可能得出陽性結(jié)論。Giaginis等〔7〕在65例胰腺癌組織中發(fā)現(xiàn)49例(75%)PPAR-γ蛋白表達(dá)陽性，并且與腫瘤分期、直徑和預(yù)后有關(guān)，認(rèn)為PPAR-γ可以作為胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

MAPKs家族是細(xì)胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，可將胞外刺激信號傳遞到細(xì)胞核，從而參與和調(diào)控細(xì)胞的多種生理病理過程〔8〕。其中P38MAPK主要參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，但近年來研究發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，并且在腫瘤發(fā)病、耐藥、轉(zhuǎn)移中也起重要作用〔9〕。P38MAPK在許多人類腫瘤，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌等呈普遍持續(xù)的過度表達(dá)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，P38MAPK蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，同國內(nèi)學(xué)者徐正府等〔10〕的研究結(jié)果一致。但是本研究發(fā)現(xiàn)，P38MAPK的過度表達(dá)與肝細(xì)胞癌的臨床病理特征無關(guān)，與患者的預(yù)后無關(guān)，提示P38MAPK通路可能主要在肝細(xì)胞癌形成的早期發(fā)揮作用，磷酸化P38MAPK為其活性形式，致癌因素等細(xì)胞外信號磷酸化激活P38MAPK通路后，其再作用于多種轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控下游基因發(fā)揮生物細(xì)胞學(xué)效應(yīng)〔11〕。而且目前研究證實(shí)，P38MAPK激活后導(dǎo)致的效應(yīng)具有細(xì)胞類型依賴性和刺激類型依賴性，即不同細(xì)胞在受到不同刺激影響時，P38MAPK所導(dǎo)致的最終結(jié)果可能是完全不同的〔12〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展過程中二者存在密切聯(lián)系。Fujita等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)，曲格列酮與PPAR-γ結(jié)合后可通過激活P38MAPK通路在體外誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡，并引發(fā)細(xì)胞的G2/M期阻滯。國內(nèi)學(xué)者劉加軍等〔13〕的實(shí)驗(yàn)顯示，PPAR-γ與配體結(jié)合后可誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞的凋亡，并認(rèn)為這與p38MAPK通路及 caspase-3的激活有關(guān)。PPAR-γ與P38MAPK蛋白在肝細(xì)胞癌中的高表達(dá)與其被激活后發(fā)揮的抑癌作用之間有何聯(lián)系，其具體機(jī)制如何，有待進(jìn)一步研究明確。

1 Reka AK，Goswami MT，Krishnapuram R，et al.Molecular cross-regulation between PPAR-γand other signaling pathways:implications for lung cancer therapy〔J〕．Lung Cancer，2011;72(2):154-9.

2 del Barco Barrantes I，Nebreda AR.Roles of p38 MAPKs in invasion and metastasis〔J〕．Biochem Soc Trans，2012;40(1):79-84.

3 Fujita M，Yagami T，F(xiàn)ujio M，et al.Cytotoxicity of troglitazone through PPARγ-independent pathway and p38 MAPK pathway in renal cell carcinoma〔J〕．Cancer Lett，2011;312(2):219-27.

4 Yao L，Liu F，Sun L，et al.Upregulation of PPARgamma in tissue with gastric carcinoma〔J〕．Hybridoma(Larchmt)，2010;29(4):341-3.

5 Lee SD.Immunohistochemical analysis of nuclear factor，p38，and cyclin D1 proteins in premalignant lesions and carcinomas of the colorectal mucosa〔J〕．Korean JGastroenterol，2008;52(6):359-67.

6 Wang W，Wang R，Zhang Z，et al.Enhanced PPAR-gamma expression may correlate with the development of Barrett＇s esophagus and esophageal adenocarcinoma〔J〕．Oncol Res，2011;19(3-4):141-7.

7 Giaginis C，Katsamangou E，Tsourouflis G，et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma and retinoid X receptor-alpha expression in pancreatic ductal adenocarcinoma:association with clinicopathological parameters，tumor proliferative capacity，and patients＇survival〔J〕．Med Sci Monit，2009;15(5):148-56.

8 Keshet Y，Seger R.The MAP kinase signaling cascades:a system of hundreds of components regulates a diverse array of physiological functions〔J〕．Methods Mol Biol，2010;661:3-38.

9 De la Cruz-Morcillo MA，Valero ML，Callejas-Valera JL，et al.P38MAPK is a major determinant of the balance between apoptosis and autophagy triggered by 5-fluorouracil:implication in resistance〔J〕．Oncogene，2012;31(9):1073-85.

10 徐正府，任雪霞，黃介飛，等.MMP-13及P38MAPK在肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用〔J〕．蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008;28(6):966-9.

11 Kim EK，Choi EJ.Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases〔J〕．Biochim Biophys Acta，2010;1802(4):396-405.

12 劉 瑞，高維娟.絲裂原活化蛋白激酶信號通路及其在細(xì)胞凋亡中的作用〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2012;32(18):4089-92.

13 劉加軍，徐 妍，劉文迭，等．環(huán)格列酮通過PPARr及P38MAPK信號途徑誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡〔J〕．中華醫(yī)學(xué)雜志，2010;90(32):2270-4.