黃 黎 周麗珍

(瀘州醫(yī)學院免疫教研室，四川 瀘州 646000)

Toll樣受體(TLRs)屬于天然免疫識別受體，能夠直接或間接結(jié)合病原體，經(jīng)吞噬及內(nèi)化將病原體及其產(chǎn)物清除出去，是抵抗外來病原微生物入侵的第一道防線，在保護牙本質(zhì)及牙髓組織健康中發(fā)揮重要作用〔1〕。已有報道指出TLR4在牙髓抵抗外來病原微生物入侵的宿主免疫防御中起到重要作用，而作為同一家族的TLR1是否有相似功能尚未可知。為此，本研究通過了解TLR1在人牙髓組織及成牙本質(zhì)細胞層中的表達及分布，探討TLR1在牙髓牙本質(zhì)復合體免疫防御中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 研究對象為本院口腔外科門診就診患者，年齡60～65歲，實驗組為臨床診斷為牙髓炎、需要拔除第三磨牙的患者，納入標準為牙體有深齲且有溫度刺激痛或自發(fā)痛但無牙周病的第三磨牙。對照組為牙體阻生需要拔除第三磨牙的患者，納入標準為牙體完整無齲病及牙周病的第三磨牙。兩組各獲得第三磨牙30顆，研究獲得所有患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色觀察健康牙髓及炎癥牙髓TLR1的分布從牙頸部將牙冠劈開后取出牙髓固定24 h，后置于30%蔗糖溶液48 h。取出牙髓后包埋，利用恒冷冰凍切片機制成10μm切片，然后黏片、脫蠟，再用市售TLR1抗體(Santa cruz公司)進行免疫組化染色，觀察TLR1的表達及分布情況。

1.2.2 RT-PCR技術(shù)檢測健康牙髓及炎癥牙髓TLR1 mRNA的表達 從牙頸部將牙冠劈開后取出牙髓，提取組織及細胞總RNA，測定純度定量后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(QIAGEN公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以TLR1引物為模板進行PCR，檢測牙髓中TLR1 mRNA的表達。

1.2.3 Western印跡技術(shù)檢測健康牙髓及炎癥牙髓的TLR1蛋白 從牙頸部將牙冠劈開后取出牙髓，提取總蛋白，行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育及二抗孵育后，最后進行TLR1蛋白的檢測。

2 結(jié)果

2.1 TLR1在牙髓組織的免疫組織化學染色 免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)對照組即健康牙髓組織成牙本質(zhì)細胞層TLR1陽性表達，部分牙髓內(nèi)血管可見環(huán)狀著色，血管內(nèi)存在陽性細胞(圖1A);牙髓內(nèi)部未發(fā)現(xiàn)或偶爾有TLR1陽性細胞(圖1B)。而觀察組即牙髓炎患者牙髓內(nèi)部可見TLR1強陽性表達(圖1C)。

2.2 Western印跡檢測TLR1的表達 Western印跡分析后發(fā)現(xiàn)觀察組和對照組牙髓及成牙本質(zhì)細胞標本均于相對分子質(zhì)量89 kD的位置有陽性條帶出現(xiàn)。見圖2。

圖1 TLR1在牙髓組織的免疫組織化學染色

圖2 Western印跡檢測TLR1的表達

2.3 TLR1 mRNA的表達 對兩組患者牙髓組織及成牙本質(zhì)細胞標本總RNA進行RT-PCR，行瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)觀察組和對照組標本在278 bp的位置均有條帶出現(xiàn)，與預期擴增產(chǎn)物大小類似。

3 討論

TLRs 是白介素-1受體(IL-1R)超家族成員，是人類進化中高度保守的分子家族，該類受體具備多種生物學功能:如可促進細胞因子的合成與釋放、誘發(fā)炎癥反應及抗病毒感染;還可誘導一氧化氮(NO)依賴性殺菌活性，促進免疫細胞表面表達相關(guān)免疫分子，促使免疫細胞的成熟等〔2，3〕。有研究發(fā)現(xiàn)，由TLRs誘導的非特異性免疫與感染、腫瘤及自身免疫性疾病密切相關(guān)，被認為是特異性免疫的啟動器〔4，5〕。人體包括口腔在內(nèi)的各器官組織均存在TLRs，故對TLRs進行深入研究可為今后探索疾病的發(fā)病機制提供另一思路，對于臨床預防和治療疾病具有重要意義〔6，7〕。

TLR1是TLRs的重要組成之一，有報道指出TLR1廣泛分布于單核細胞、中性粒細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞等多種免疫細胞，可識別多種微生物中脂蛋白等分子模式，并通過TLR1/2異二聚體刺激免疫應答，與人類多種疾病的發(fā)病密切相關(guān)〔8～10〕。在口腔炎癥免疫方面，當前對TLRs研究較清楚的是TLR4和TLR2，而有關(guān)TLR1蛋白是否在牙髓組織表達、其表達情況與牙髓組織炎癥免疫有何種關(guān)系，國內(nèi)尚無相關(guān)報道。

本組研究中免疫組化結(jié)果表明在正常牙髓血管內(nèi)皮細胞、血管周圍及血管內(nèi)均存在TLR1免疫反應陽性細胞，而PR-PCR結(jié)果亦表明正常牙髓組織有TLR1表達，可能與取出的牙髓組織中存在成牙本質(zhì)細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞等可表達TLR1的免疫細胞有關(guān)，由此可認為TLR1在牙髓組織免疫應答過程中起到較大作用，可能通過誘發(fā)免疫應答從而引起血管內(nèi)皮細胞等免疫細胞活化以避免病原微生物入侵。另外，免疫組化發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)細胞質(zhì)及突起以及位于成牙本質(zhì)細胞層附近的樹突細胞膜及胞質(zhì)均有TLR1表達，且發(fā)現(xiàn)在正常牙髓組織中成纖維細胞并未表達TLR1，牙齦及牙周膜成纖維細胞同牙髓成纖維細胞存在相似性，但觀察組牙髓組織的牙髓成纖維細胞TLR1則強陽性表達，與既往對TLR4的研究結(jié)果類似，提示TLR1表達與細胞分布部位及功能狀態(tài)相關(guān)〔7〕。正常狀態(tài)下牙髓成纖維細胞因為有成牙本質(zhì)細胞包繞故不會受病原微生物刺激，但當牙本質(zhì)被破壞后，牙髓成纖維細胞因外界病菌侵入就可能會活化并表達TLR1。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)牙髓組織中TLR1的表達情況與細胞分布、功能狀態(tài)等密切相關(guān)，具有和TLR4相似的時空特異性，在正常情況下戰(zhàn)略性分布于成牙本質(zhì)細胞及牙髓內(nèi)部血管周圍，為抵御外來病原微生物入侵做好準備，在牙髓及牙本質(zhì)免疫復合體免疫防御反應中發(fā)揮重要作用。

1 閆 浩，李 妍，馬美娟，等.胰島素在巨噬細胞泡沫化過程中對Toll樣受體4表達的影響及其機制〔J〕．現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2013;13(9):1605-8，1604.

2 Khoo JJ，F(xiàn)orster S，Mansell A.Toll-like receptors as interferon-regulated genes and their role in disease〔J〕．J Interferon Cytokine Res，2011;31(1):13-25.

3 Kutikhin AG.Association of polymorphisms in TLR genes and in genes of the Toll-like receptor signaling pathway with cancer risk〔J〕．Hum Immunol，2011;72(11):1095-116.

4 Alexopoulou L，Desnues B，Demaria O.Toll-like receptor 8:the awkward TLR〔J〕．Med Sci(Paris)，2012;28(1):96-102.

5 Lee NY，Lee HY，Lee KH，et al.Vibrio vulnificus IlpA induces MAPK-mediated cytokine production via TLR1/2 activation in THP-1 cells，a human monocytic cell line〔J〕．Mol Immunol，2011;49(1-2):143-54.

6 Lancioni CL，Li Q，Thomas JJ，et al.Mycobacterium tuberculosis lipoproteins directly regulate human memory CD4(+)T cell activation via Tolllike receptors 1 and 2〔J〕．Infect Immun，2011;79(2):663-73.

7 Oosting M，Ter Hofstede H，Sturm P，et al.TLR1/TLR2 heterodimers play an important role in the recognition of Borrelia spirochetes〔J〕．PLoS One，2011;6(10):e25998.

8 Plantinga TS，Johnson MD，Scott WK，et al．Toll-like receptor 1 polymorphisms increase susceptibility to candidemia〔J〕．J Infect Dis，2012;205(6):934-43.

9 Dasari P，Zola H，Nicholson IC，et al.Expression of Toll-like receptors by neonatal leukocytes〔J〕．Pediatr Allergy Immunol，2011;22(2):221-8.

10 Zhu J，Krishnegowda G，Li G，et al.Proinflammatory responses by glycosylphosphatidylinositols(GPIs)of Plasmodium falciparum are mainly mediated through the recognition of TLR2/TLR1 〔J〕．Exp Parasitol，2011;128(3):205-11.