王小敏，王小燕，楊聯(lián)君，韓萍

(深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院婦科，深圳龍崗518112)

絨毛組織中抑制素A表達(dá)與稽留流產(chǎn)的相關(guān)性研究*

王小敏，王小燕，楊聯(lián)君，韓萍

(深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院婦科，深圳龍崗518112)

目的研究抑制素A在早期正常妊娠、稽留流產(chǎn)患者絨毛中的定位及表達(dá)水平，探討抑制素A與稽留流產(chǎn)的相關(guān)性。方法選取2012年8月至2013年10月期間自愿在我院婦科終止妊娠的80例患者，其中20例正常早孕要求人工流產(chǎn)者為對(duì)照組，稽留流產(chǎn)60例，后者根據(jù)胚胎停止發(fā)育至排出母體外的時(shí)間，分成A組(＜2周)，B組(2～4周)以及C組(＞4周)(n=20)。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，檢測絨毛組織中抑制素A表達(dá)情況。結(jié)果抑制素A在對(duì)照組、稽留流產(chǎn)組絨毛的合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿呈不同程度的陽性染色?；袅鳟a(chǎn)組絨毛抑制素A的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，但A、B、C 3組間表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論絨毛組織中抑制素A對(duì)于正常早期妊娠的維持起重要作用，抑制素A表達(dá)水平降低可能在稽留流產(chǎn)發(fā)生過程中具有重要作用。

抑制素A;稽留流產(chǎn);絨毛組織

抑制素A屬于轉(zhuǎn)化生長因子－β(transformation growth factor－β，TGF－β)的超家族成員，妊娠期主要來源于胎盤的分泌。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抑制素A在母體正常表達(dá)對(duì)妊娠的維持和發(fā)展起重要作用［1］。本文通過研究稽留流產(chǎn)和正常早孕患者絨毛組織中抑制素A的表達(dá)，探討其與稽留流產(chǎn)的相關(guān)性，為稽留流產(chǎn)病因的深入研究和臨床防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象選取2012年8月至2013年10月期間自愿在深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院婦科終止妊娠的80例患者，其中20例自愿要求行人工流產(chǎn)的正常早孕患者為對(duì)照組，稽留流產(chǎn)患者60例為病例組，行清宮術(shù)，其診斷標(biāo)準(zhǔn)參照人民衛(wèi)生出版社《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版［2］。按照胚胎停止發(fā)育至排出母體外的時(shí)間，將觀察組再分成A組(＜2周)，B組(2～4周)以及C組(＞4周)3組，每組20例?；颊吣挲g20～40歲，孕次1～4次，產(chǎn)次0～3次，均為單胎，孕周6～12+6周，各組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本次孕期無特殊用藥史，無放射線及化學(xué)物質(zhì)接觸史，無生殖器畸形和感染性疾病，無妊娠并發(fā)癥及合并癥。

1.1.2 標(biāo)本收集將絨毛置于生理鹽水中漂洗2次后，置于中性甲醛固定液中固定24～48h，酒精梯度脫水，經(jīng)二甲苯透明后，石蠟包埋，各制備4μm切片備用。

1.1.3 主要試劑一抗:兔抗人多克隆抗體(抑制素A)，二抗:生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記的鏈酶親和素、DAB顯色試劑盒，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法抑制素A蛋白的檢測按相應(yīng)操作步驟，參照說明書進(jìn)行。試劑盒提供陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)步驟如下:60℃烤片2h;二甲苯脫蠟15min，3次;依次經(jīng)過無水乙醇、95%、90%、80%、70%的乙醇，各5min，蒸餾水5min水化;PBS洗5min，3次;枸櫞酸緩沖液(約92℃～95℃)煮沸抗原修復(fù)15min，自然涼至室溫。PBS洗5min，3次;3%雙氧水封閉20min，PBS洗5min，3次;正常山羊血清封閉，37℃20min;一抗孵育，4℃過夜;復(fù)溫20min，PBS洗5min，3次;二抗孵育37℃20min，PBS洗5min， 3次;三抗孵育37℃20min;PBS洗5min，3次; DAB顯色，鏡下觀察結(jié)果，適時(shí)終止;蘇木素復(fù)染5min，自來水沖洗片刻，1%的鹽酸酒精(75%)溶液分化30s，自來水沖洗5min藍(lán)化;依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%、無水乙醇脫水，各5min，二甲苯15min，3次;封片，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.2 結(jié)果判定以滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，染色明顯高于背景為陽性，采用圖像分析軟件Olympus CellSens Dimension對(duì)其進(jìn)行定量分析，每張切片放大200倍后隨機(jī)取10個(gè)不重疊的視野，以平均光密度(optical density，OD)代表抑制素A著色強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以ˉx±s的形式表示，用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制素A在各組絨毛中的表達(dá)定位免疫組化結(jié)果顯示，在陰性對(duì)照片中，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿中未見棕黃色顆粒，無陽性染色，見圖1A。對(duì)照組絨毛的合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿均呈陽性染色，位于絨毛最外層的合體滋養(yǎng)細(xì)胞和其內(nèi)層的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞陽性染色最強(qiáng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞次之，絨毛間質(zhì)無陽性染色，見圖1B。抑制素A在稽留流產(chǎn)組絨毛中的表達(dá)定位與對(duì)照組相一致，但染色程度明顯低于對(duì)照組，以A組為代表，見圖1C。

圖1 免疫組化法檢測抑制素A在絨毛中的表達(dá)

2.2 抑制素A在各組絨毛中的表達(dá)水平定量分析表明，與對(duì)照組相比，抑制素A在稽留流產(chǎn)組的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?；袅鳟a(chǎn)組按照胚胎停止發(fā)育至排出母體外的時(shí)間長短不同分成3組，A、B、C 3組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 抑制素A在各組絨毛中的表達(dá)(OD值，ˉx±s)

3 討論

抑制素與女性生殖內(nèi)分泌關(guān)系密切，其中抑制素A是整個(gè)妊娠過程中抑制素的主要存在形式，在妊娠期的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中發(fā)揮了更重要的作用［3］。妊娠早期，抑制素A在子宮內(nèi)膜蛻膜化、免疫耐受、種植準(zhǔn)備、胚胎及滋養(yǎng)細(xì)胞的種植和分化中起重要調(diào)節(jié)作用，調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮蛻膜，使子宮內(nèi)膜形成胎盤的母體部分［4，5］。抑制素A的水平是維持正常早期妊娠的必要條件［5，6］。國內(nèi)外研究認(rèn)為，胎盤組織分泌的抑制素A既可以分泌入母體血液循環(huán)，也可以分泌入胎兒血液循環(huán)，起到調(diào)節(jié)妊娠期母體促性腺激素釋放、雌孕激素的分泌和胎兒的生長發(fā)育的作用;同時(shí)又能夠以旁分泌或自分泌方式參與胎盤局部調(diào)節(jié)軸中促性腺激素釋放激素、人絨毛膜促性腺激素、雌孕激素等各種激素之間的生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，從而影響著妊娠的發(fā)生、發(fā)展及胎兒的生長發(fā)育［7］。

稽留流產(chǎn)是自然流產(chǎn)的一種特殊類型，一直來也是優(yōu)生優(yōu)育領(lǐng)域重要的研究課題。林春麗等［8，9］研究發(fā)現(xiàn)稽留流產(chǎn)組血清抑制素A水平低于正常妊娠組，提示抑制素A對(duì)稽留流產(chǎn)的診斷和預(yù)測具有一定價(jià)值，但對(duì)于其在胎盤絨毛組織中的表達(dá)研究不多。通過研究，我們發(fā)現(xiàn)抑制素A在稽留流產(chǎn)和對(duì)照組絨毛的合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿均呈陽性染色，位于絨毛最外層的合體滋養(yǎng)細(xì)胞和其內(nèi)層的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞陽性染色最強(qiáng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞次之，絨毛間質(zhì)無陽性染色，與張鈺等［3］的研究結(jié)果一致。但Kondi［10］等發(fā)現(xiàn)早孕期抑制素A表達(dá)在合體滋養(yǎng)細(xì)胞和中間滋養(yǎng)細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞卻不表達(dá)，分析原因可能與不同研究所采用抑制素A抗體所針對(duì)抗原決定簇的特異性不同有關(guān)。

此外，我們研究發(fā)現(xiàn)抑制素A在稽留流產(chǎn)及正常早期妊娠絨毛中均有一定程度表達(dá)，稽留流產(chǎn)中的表達(dá)明顯低于正常早孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但胚胎停止發(fā)育后滯留母體內(nèi)的時(shí)間長短對(duì)抑制素A表達(dá)水平無明顯影響(P＞0. 05)，可能與其半衰期短(45min)有關(guān)系，說明抑制素A水平下降與稽留流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)，同時(shí)也提示抑制素A可作為一個(gè)早期發(fā)現(xiàn)稽留流產(chǎn)的臨床生化指標(biāo)，為稽留流產(chǎn)的早期診斷提供了新思路。

我們推測，由于胎盤絨毛合成抑制素A能力降低，一方面可能引起妊娠期母體激素分泌、物質(zhì)代謝紊亂，另一方面還可能引起胎盤局部激素、細(xì)胞因子等內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，使胎盤局部調(diào)節(jié)軸中人絨毛膜促性腺激素、雌孕激素等各種激素合成釋放紊亂，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕能力降低，胎盤淺著床，同時(shí)還影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化、胚泡植入，影響胚胎的生長發(fā)育，最終導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育，發(fā)生稽留流產(chǎn)。

綜上所述，抑制素A水平下降與稽留流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)，為臨床早期診斷和防治稽留流產(chǎn)的發(fā)生提供了理論依據(jù)和新思路，然而抑制素A對(duì)生殖過程的精細(xì)調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步研究。

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Expression of Inhibin A in the Villi of Missed Abortion

WANG Xiao－min，WANG Xiao－yan，YANG Lian－jun，et al
(Department of Gynecology，The Second People＇s Hospital of Longgang District，Shenzhen Guangzhou 518112，China)

ObjectiveTo study the expression of inhibin A in the villi of patients with normal early pregnancy and missed abortion，and the correlation between inhibin A and missed abortion.Methods80 patients registered to the Department of Gynecology in our hospital between August 2012 and October 2013 were collected.20 cases of normal early pregnancy with artificial abortion were served as control group.60 cases of missed abortion were divided into three groups according to the time between embryo death and removal from pregnant women:Group A(≤2weeks)，Group B(2～4weeks)and Group C(≥4weeks)(n=20).The expression of inhibin A was determined by immunohistochemistry technology and computer image analysis systems.ResultsInhibin A exhibited positive staining at the cytoplasm of syncytiotrophoblast，cytotrophoblast and capillary endothelial cell of villi.The expression of inhibin A in the villi of the missed abortion group was less than that in the control group(P＜0.05).There were no significant differences of inhibin A expression in villi among groupA，B and C(P＞0.05).ConclusionInhibin A from villi plays an important role in sustaining normal early pregnancy. The low expression of inhibin A may play an important role in the process of missed abortion.

Inhibin A;Missed abortion;Villi

R714.2

A

2095－4646(2015)01－0016－03

2014－12－01)

深圳市龍崗區(qū)科技創(chuàng)新局資助項(xiàng)目(YS2011073)