潘海媛，嚴星，姜鵬

(1.解放軍第82醫(yī)院呼吸科，江蘇淮安223001;2.解放軍第82醫(yī)院骨科)

褪黑素對人肺腺癌A549細胞的影響及作用機制的研究*

潘海媛1，嚴星1，姜鵬2＊＊

(1.解放軍第82醫(yī)院呼吸科，江蘇淮安223001;2.解放軍第82醫(yī)院骨科)

目的探討褪黑素(MLT)對體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響及作用機制。方法體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞，通過不同濃度的褪黑素(0、0.1、0.5、1.0mmol/L)干預(yù)24、48、72h，通過劃痕實驗測定細胞遷移能力變化，Transwell侵襲小室測定實驗檢測MLT對A549細胞侵襲能力的影響，RT－PCR法檢測MLT對細胞中NF－κBp65 mRNA表達的影響。結(jié)果褪黑素能夠抑制人肺腺癌A549細胞遷移和侵襲能力，同時細胞內(nèi)NF－κBp65mRNA量明顯減少。結(jié)論褪黑素能夠呈劑量依賴性抑制人肺腺癌A549細胞的遷移及侵襲，抑制核因子κBp65基因的轉(zhuǎn)錄是可能作用路徑之一。

褪黑素;肺腺癌;核因子κB;遷移;侵襲

肺癌是最常見的腫瘤之一，并且發(fā)病率呈上升趨勢，這與全世界的工業(yè)化、空氣污染、吸煙等有關(guān)，其治療手段多樣，包括手術(shù)、放療、化療及生物治療，尤其是分子靶向治療發(fā)展迅速，但總體治療效果并不令人滿意，5年存活率較低，腫瘤的早期轉(zhuǎn)移可能是治療效果不佳的重要原因。褪黑素是一種主要由松果體分泌的天然激素［1］，最早的研究重點是其生物鐘作用［2］，近年來的研究表明，褪黑素可能通過誘導腫瘤細胞凋亡［3］、拮抗某些生長因子如血管生成、侵襲等促進因子、調(diào)節(jié)機體免疫力［4］、對其他治療的協(xié)同作用［5］、調(diào)節(jié)心理狀態(tài)［6］等發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究主要探討褪黑素對A549細胞遷移和侵襲能力的影響，并進一步驗證可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和試劑人肺腺癌A549細胞由唐都醫(yī)院胸外科實驗室提供。主要試劑:胎牛血清(四季青公司)，低糖DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，褪黑素(Sigma公司)，人工基底膜材料(Matrigel)及Transwell小室(BD公司)，Trizol試劑盒及RTPCR試劑盒(Takara公司)。主要儀器:電熱恒溫干燥箱(北京科偉永興儀器公司)，顯微鏡(徠卡公司)，實時定量PCR儀(Bio－Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha公司)。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組復蘇凍存的人肺腺癌A549細胞，加入含雙抗(青霉素、鏈霉素各100 U/ ml)體積分數(shù)10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2恒溫37℃、培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第2d換液，以后隔天更換培養(yǎng)液，待貼壁細胞約80%融合時，0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。根據(jù)我們前期的實驗結(jié)果，1.0mmol/L的MLT 48h內(nèi)對細胞的增殖無明顯影響，實驗按照MLT濃度分為4組(n=4)，MLT終濃度分別為0mmol/L(對照組control)、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L。實驗重復3次。

1.2.2 劃痕實驗檢測MLT對細胞遷移能力的影響0.25%胰酶消化細胞，10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化并吹打成細胞懸液，按3×104/孔接種入24孔板內(nèi)，每組設(shè)6孔，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當培養(yǎng)至細胞融合約60%時進行實驗。吸出培養(yǎng)液，用200μl槍頭小心在孔底劃痕，用無血清培養(yǎng)液將洗滌2次，吸凈，加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下選擇劃痕較直且無細胞殘留的部位板底劃線標記并拍照記錄，繼續(xù)培養(yǎng)。24h后吸去培養(yǎng)液，換加含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，并加入不同量MLT，使其終濃度分別為0mmol/L、0.1 mmol/ L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)18h，取出24孔板，對照第1次照片，顯微鏡下尋找拍照部位，相同放大倍數(shù)再次拍照。按照細胞遷移距離= (24h前細胞間距－24h后細胞間距)/2計算細胞實際遷移距離。以對照組平均距離記為1，各實驗組取相對數(shù)標準化計算。

1.2.3 Transwell侵襲小室測定實驗檢測MLT對細胞侵襲能力的影響實驗前晚從20℃冰箱中取出人工基底膜材料，4℃過夜融化成液態(tài)，用4℃培養(yǎng)基10倍稀釋。吸取50μl稀釋后的基底膜材料滴入8μm Transwell小室中，放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h。4h后吸出小室內(nèi)未凝固液體，將小室懸掛入24孔板內(nèi)待用。胰酶消化細胞，不含血清的培養(yǎng)基終止消化并吹打成細胞懸液，計數(shù)調(diào)整細胞濃度至約2.5×105/ml，每小室內(nèi)加入細胞懸液180μl，并加入MLT濃度為0 mmol/L、1mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L的不含血清培養(yǎng)基20μl，小室外加含10%FBS的培養(yǎng)基500μl，每濃度設(shè)6個小室。放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h后取出小室，棉簽擦去基底膜上層細胞，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定30min，蘇木素染色，自來水沖洗。400倍顯微鏡隨意選取16個視野計數(shù)，以對照組細胞平均數(shù)記為1，各實驗組取相對數(shù)標準化計算。

1.2.4 RT－PCR法檢測MLT對細胞中NF－κBp65mRNA表達的影響將肺腺癌A549細胞懸液按3×104/孔接種入24孔板中，每濃度設(shè)6孔，置入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后吸去培養(yǎng)液，換加含10%FBS的培養(yǎng)基，并加入含不同濃度MLT的培養(yǎng)基，使其終濃度分別為0mmol/L、0.1 mmol/ L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用Trizol試劑盒提取總RNA。根據(jù)NF－κBp65基因序列設(shè)計引物序列，上游引物為5＇－CCACTTACGGATTCTGGTGG－3＇，下游為5＇－CTCAAACGCTGGTGTTAGGC－3＇，長度426bp;β－actin內(nèi)參基因上游引物為5＇－GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA－3＇，下游引物為5＇－GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG－3＇，長度496bp(引物由上海生工合成)。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，變性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，重復30個循環(huán);擴增β－actin基因:94℃預(yù)變性5min，變性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，重復30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后凝膠成像分析系統(tǒng)分析，以對照組平均值記為1，各實驗組取相對數(shù)標準化計算。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)用(ˉx±s)表示，對主要數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，多組間比較采用SNK－q檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 劃痕實驗結(jié)果按照公式算得細胞遷移距離，經(jīng)標準化，0 mmol/L、0.1mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L各組遷移距離為1、0.790±0.148、0.582 ±0.119、0.327±0.062。經(jīng)檢驗，各濃度加藥干預(yù)組與對照組相比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，0.5 mmol/L組與0.1mmol/L組相比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，1mmol/L組與其他各組相比均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果提示褪黑素能抑制A549細胞的遷移能力，且作用呈一定劑量依賴性。

2.2Transwell侵襲小室測定實驗結(jié)果各組小室基底膜下層細胞染色后顯微鏡下觀察計數(shù)，各濃度分別為1、0.856±0.081、0.476±0.064、0.301± 0.069。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，0.1 mmol/L組與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，0.5 mmol/L組、1.0 mmol/L組與對照組及比較有統(tǒng)計學意義(P＜0. 05)，組間比較顯示1.0mmol/L與0.1mmol/L組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，1.0mmol/L與0. 5mmol/L組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)果提示，MLT能夠抑制肺腺癌A549細胞的侵襲能力，并且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

2.3 RT－PCR結(jié)果RT－PCR結(jié)果顯示，隨著MLT濃度的增高，細胞NF－κBp65 mRNA逐漸下降，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，各組之間均有統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示MLT呈劑量依賴性的抑制NF－κBp65基因的轉(zhuǎn)錄。見圖1。

圖1 MLT對A549細胞作用后NF－κBp65的Rt－PCR檢測

3 討論

姜鵬［7］等人實驗證實了高濃度的MLT對肺腺癌A549細胞增殖有顯著的抑制作用，實驗結(jié)果顯示0.1～1.0 mmol/L的MLT作用24h對A549細胞的增殖無明顯影響，故本實驗選擇0.1～1.0mmol/L之間的濃度作為實驗條件，以避免細胞增殖受明顯抑制對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

通過嚴格的實驗我們發(fā)現(xiàn)MLT能夠抑制腫瘤的遷移和侵襲能力，并且呈一定的劑量依賴性，提示MLT可能有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，可用于腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防。

NF－κB是一種細胞中普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子，非活化時以p50/p65異二聚體形式在胞漿中存在［8］，并與特異性的調(diào)節(jié)蛋白IκB－α結(jié)合，在IκB激酶(IKK)作用下p50/p65異二聚體可與IκB－α分離，并轉(zhuǎn)位進入細胞核與特定啟動子結(jié)合，誘導靶基因mRNA的合成［9～11］，參與炎癥、細胞增殖及凋亡多種生理病理反應(yīng)［12］。多項研究表明，多數(shù)腫瘤細胞內(nèi)NF－κB呈非正常活化狀態(tài)［13］，參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等過程。有研究證實，NF－κB異常活化時通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮白細胞黏附分子、血管細胞粘附分子、金屬蛋白酶等的表達［14，15］，參與浸潤及轉(zhuǎn)移過程。p65亞基是NF－κB的主要活性亞基［16］，活化后發(fā)生核移位與目的DNA結(jié)合后調(diào)節(jié)下游基因的表達［17］。通過檢測發(fā)現(xiàn)MLT能夠下調(diào)NF－κBp65mRNA量，這說明MLT對NF－κBp65基因的轉(zhuǎn)錄活性有明顯的抑制作用。本實驗結(jié)果提示MLT能通過抑制NF－κBp65基因的轉(zhuǎn)錄來抑制A549細胞的遷移和侵襲能力，但MLT如何抑制NF－κBp65基因的轉(zhuǎn)錄還有待進一步實驗解釋。

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The Effect and Mechanism of Melatonin on Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells

PAN Hai－yuan，YAN Xing，JIANG Peng
(Department of Respirations NO．82 Hospital of PLA，Huaian Jiangsu 223001，China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of melatonin(MLT)on the migration and invasion of cultured human lung adenocarcinoma A549 cell.MethodsHuman lung adenocarcinoma A549 cells were treated by different concentration of melatonin(0，0.1，0.1，1.0 mmol/L)for 24，48 or 72 h.The migration changes were tested by the scratch test.The effect of MLT on the invasive ability of A549 cells were measured by transwell invasion.RT－PCR was used to detect the effects of MLT on NF－κBp65 mRNA expression.ResultsMelatonin can inhibit the migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell accompanying with reducing the amount of NF－κBp65mRNA cells.ConclusionMelatonin can dose－dependently inhibit the migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell.Inhibition of NF－κBp65 mRNA gene transcription is one of the possible role of the path.

Melatonin;Lung adenocarcinoma;Nuclear factor κB;Migration;Invasion

R734.2

A

2095－4646(2015)01－0009－04

2014－10－15)

淮安市科技支撐項目(HAS2012020)

＊＊通訊作者，E－mail:bigbird01@163.com