張博，王顯紅，尹時華

(1.湖北科技學院五官醫(yī)學院，湖北咸寧437100;2.廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)

水楊酸鈉對小鼠耳蝸單離外毛細胞Prestin分布的影響

張博1，王顯紅1，尹時華2

(1.湖北科技學院五官醫(yī)學院，湖北咸寧437100;2.廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)

目的探討水楊酸鈉對小鼠聽性腦干反應(yīng)(ABR)閾值和耳蝸外毛細胞動力蛋白(Prestin)分布的影響。方法將28只成年健康小鼠隨機分為4組:生理鹽水對照組(A組)、水楊酸鈉4d組(B組)、水楊酸鈉8d組(C組)、水楊酸鈉16d組(D組)。水楊酸鈉200mg/kg·d，經(jīng)腹腔注射，采用美國TDT系統(tǒng)測量聽性腦干反應(yīng)(ABR)閾值，熒光顯微鏡下觀察單離外毛細胞Prestin的分布。結(jié)果①聽功能檢測顯示:與A組比較，B組小鼠ABR閾值升高，但變化尚不顯著(P＞0.05);C組和D組小鼠ABR閾值明顯提高，與A組比較有顯著性差異(P＜0.05);D組小鼠ABR閾值與C組比較有所降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。②熒光顯微鏡下顯示:A組單離外毛細胞側(cè)膜和底部膜可見明顯的Prestin抗體陽性染色，B、C、D組Prestin在外毛細胞膜上分布不均勻，主要分布在外毛細胞側(cè)膜。B組底部細胞膜可見少量陽性染色，C、D組底部細胞膜少量或無Prestin的陽性染色。結(jié)論水楊酸鈉致小鼠聽力下降可能與其導致的外毛細胞底部膜Prestin表達異常有關(guān)。

水楊酸鈉;耳蝸;外毛細胞;外毛細胞動力蛋白;小鼠

耳蝸具有頻率選擇和放大效應(yīng)，這一生理特征被認為與耳蝸外毛細胞(outer hair cells，OHC)的電能動性有關(guān)。大量的資料證實［1，2］，OHC的電能動性與其側(cè)壁上外毛細胞動力蛋白(Prestin)有緊密聯(lián)系。Prestin又稱為動力蛋白(motor protein)，是電運動和耳蝸放大效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。水楊酸鈉是臨床常用的解熱、鎮(zhèn)痛、抗風濕藥物，長時間或高劑量應(yīng)用容易產(chǎn)生毒副作用，主要表現(xiàn)為可逆的雙耳對稱性高調(diào)耳鳴和聽力下降［3］。關(guān)于水楊酸鈉毒副作用機制研究很多，但確切機制尚不完全清楚。耳蝸電生理學和形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，OHC是水楊酸鈉耳毒性作用的靶細胞，OHC功能的改變在水楊酸鈉耳毒性機理研究中起重要作用［4，5］。近年來隨著OHC膜Prestin的發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉耳毒性作用與Prestin之間的關(guān)系也成為研究熱點。本實驗以小鼠為研究對象，觀察水楊酸鈉對聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)閾值和外毛細胞動力蛋白分布的影響，以此探討水楊酸鈉的耳毒性機制，從而為指導臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與給藥28只經(jīng)檢測聽閾正常的成年健康小鼠(廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，雌雄不限，體重分布在18～25 g。隨機分為4組，每組7只。生理鹽水對照組(A組)、水楊酸鈉4d組(B組)、水楊酸鈉8d組(C組)、水楊酸鈉16d組(D組)。B、C、D組均經(jīng)腹腔注射水楊酸鈉200mg/kg·d，分別在4、8、16d進行ABR檢測，A組給等量生理鹽水，水楊酸鈉注射液購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 聽性腦干反應(yīng)(ABR)閾值檢測各組小鼠用美國TDT系統(tǒng)進行雙側(cè)ABR測試。小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(上海西唐科技公司)按35～40 mg/ kg腹腔注射麻醉，實驗在隔聲屏蔽室內(nèi)進行。微型記錄電極放置于兩耳廓前沿連線中點，參考電極置于同側(cè)耳垂，地線接鼻尖。實驗采用短聲(Click)，帶通濾波為300～3000 Hz，疊加次數(shù)為1024次，掃描時間10ms。起始給聲95 dB SPL，以5 dB SPL或者10 dB SPL依次遞減，以能引出明確的、可重復的觀察波形的最小刺激強度為聽反應(yīng)閾。

1.3 外毛細胞分離培養(yǎng)及免疫熒光染色ABR閾值檢測后，各組動物迅速斷頭并取出顳骨，打開聽泡置于PBS溶液中，在解剖顯微鏡下剝?nèi)ノ仛?，用游絲鑷剔除螺旋韌帶和螺旋神經(jīng)節(jié)組織后分離出含Corti器的基底膜，移除Reissner氏膜和Tectorial膜，置于濃度為0.25 mg/ml的木瓜蛋白酶中，37℃孵育10～12min，輕柔吹打后用加有10%胎牛血清的DMEM液終止消化。懸液經(jīng)離心后去上清液，加入1 ml培養(yǎng)液在37℃，5%CO2孵箱孵育24h。經(jīng)24h培養(yǎng)后的外毛細胞用4%多聚甲醛固定30min，PBS浸洗5min，3次。封閉液(10%山羊血清和1%BSA)封閉30min，PBS浸洗5min，3次。1∶1 000羊抗Prestin多克隆抗體(Prestin Antibody(C－16):Sc－22694，Santa Cruz) 4℃過夜，室溫復溫10min，PBS浸洗5min，3次。1∶64的FITC標記的兔抗羊IgG二抗抗體(BA1l10，武漢博士德)在室溫下孵育1h，PBS浸洗5 min，3次。封片后熒光顯微鏡下觀察，陽性染色為綠色熒光。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計學分析軟件，實驗數(shù)據(jù)以(ˉx±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值變化與正常對照組比較，連續(xù)用藥4d，小鼠ABR閾值水平提高，但變化尚不顯著(P＞0.05);8d和16d組小鼠ABR閾值明顯提高，與對照組或4d組比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05);16d組小鼠ABR閾值與8d組比較有所降低，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠ABR閾值比較(dBSPL，ˉx±s，n=7)

2.2 耳蝸單離外毛細胞膜Prestin分布熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡下顯示，A組單離0HC側(cè)膜和底部膜可見明顯的Prestin抗體陽性染色，Prestin表達較均一完整。B、C、D組Prestin分布不均勻，主要分布在OHC側(cè)膜。B組底部細胞膜可見少量陽性染色，C、D組底部細胞膜少量或無Prestin蛋白的陽性染色。

3 討論

人們已經(jīng)知道，能夠?qū)β暡ㄒ鸬亩伝啄ふ駝舆M行放大和修飾的外毛細胞電運動，是哺乳動物內(nèi)耳聽覺器官高靈敏度和頻率選擇性的基礎(chǔ)。當聲音刺激傳入耳蝸引起基底膜振動時使外毛細胞頂部纖毛發(fā)生偏移，從而開放纖毛頂端的機械換能通道，產(chǎn)生換能電流。外毛細胞還可由于其膜電位和膜電流的變化導致自身產(chǎn)生收縮與舒張運動，外毛細胞具有的這種電－機械換能特性被稱為電能動性，其可對基底膜的運動進行反饋性調(diào)制，實現(xiàn)耳蝸放大作用。

大量的資料證實，OHC的電能動性與其側(cè)壁上Prestin有緊密聯(lián)系。Prestin又稱為動力蛋白，是外毛細胞電－機械活動和耳蝸放大作用所必需的蛋白，并特異性地在耳蝸外毛細胞膜上表達［6，7］。近年來有人對單離外毛細胞Prestin抗體免疫熒光染色發(fā)現(xiàn):Prestin不僅分布在外毛細胞側(cè)膜上，而且在基底部側(cè)膜與細胞底端細胞膜也存在［8］。Liberman等通過對Prestin基因缺失小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠聽閾上升且OHC能動性喪失，說明Prestin基因及其蛋白在外毛細胞電能動性中發(fā)揮著重要作用［9］。

Prestin作為動力蛋白具有兩個基本功能:①電壓感受器功能，可感受外毛細胞的跨膜電壓改變;②驅(qū)動器功能(即電－機械力的轉(zhuǎn)換器功能)，Prestin通過本身構(gòu)型變化促使外毛細胞伸長和縮短，其可單獨完成電－機械轉(zhuǎn)換過程，不需要額外的能量消耗或細胞骨架結(jié)構(gòu)的參與。細胞膜電壓的變化，可誘發(fā)其構(gòu)象變化，從而引起外毛細胞長度改變。外毛細胞質(zhì)膜去極化引起胞體縮短，超極化引起胞體伸長［1，10］。

由于Prestin屬于陰離子轉(zhuǎn)運家族SLC26的成員，因此也顯示出與陰離子轉(zhuǎn)運器相似的一些特征。有人推測Prestin是一個被修飾的陰離子轉(zhuǎn)運器，細胞內(nèi)陰離子(Cl－或HCO3－)對外毛細胞電運動和Prestin的功能具有重要意義。單價陰離子尤其是Cl－被證實為其最有效的刺激因素。Cl－與Prestin結(jié)合位點結(jié)合，導致Prestin構(gòu)象的改變，引起OHC體壁的伸縮變化，從而產(chǎn)生電能動性。在去除細胞質(zhì)內(nèi)的Cl－后，可使轉(zhuǎn)染Prestin細胞的電動性和非線性電容(門電流)均消失［11，12］。

水楊酸鈉是一種臨床上廣泛使用的藥物，長期應(yīng)用會引起聽力下降及耳鳴等臨床癥狀。目前關(guān)于水楊酸鈉毒副作用機制研究很多，其確切機制尚不完全清楚。電化學研究表明［13，14］，水楊酸鈉是Prestin陰離子結(jié)合位點的競爭性拮抗劑，其與Prestin上陰離子結(jié)合位點的親和力是Cl－的300倍，但結(jié)合后所產(chǎn)生的電－機械運動遠小于Cl－。因此注射大劑量水楊酸鈉使OHC電能動性減小，是導致聽力損失的可能原因之一。我們實驗中也觀察到:連續(xù)用藥4d后，小鼠即出現(xiàn)ABR閾值升高，聽力下降，尤其C組表現(xiàn)得最為明顯，結(jié)果說明水楊酸鈉對聽力有損傷作用，另外D組ABR閾值低于C組似乎表明小劑量水楊酸鈉所導致聽力下降具有自我恢復的特點。熒光顯微鏡下顯示:A組OHC膜可見Prestin抗體陽性染色，其中包括細胞側(cè)膜與底端膜，Prestin分布較均一完整;B、C、D組Prestin在外毛細胞膜上分布不均勻，尤其C、D組OHC底端膜少或無Prestin蛋白的陽性染色。結(jié)果提示:水楊酸鈉致小鼠聽力損害與外毛細胞底部膜Prestin表達異常存在密切關(guān)聯(lián)。其產(chǎn)生可能原因:①水楊酸鈉是Prestin陰離子結(jié)合位點的競爭性拮抗劑，能使Cl－與Prestin結(jié)合位點的親和力下降，導致OHC電能動性減小。②本實驗注射水楊酸鈉后，外毛細胞膜Prestin分布發(fā)生變化，尤其底部膜Prestin分布減少或消失。由于外毛細胞底端為突觸所在部位，底部的突觸實際上也具有傳入神經(jīng)的成分，有人推測可能有其傳入性的信號需要經(jīng)過外毛細胞及其突觸結(jié)構(gòu)的處理，其中Prestin可能參與了這些傳入性的信號處理過程，Prestin在神經(jīng)遞質(zhì)囊泡釋放過程中起重要作用［8，15］，外毛細胞底部膜Prestin分布減少可能影響此作用。組織學研究也表明，水楊酸鈉可以導致毛細胞底側(cè)膜系統(tǒng)的膜下池明顯腫脹、空泡形成［4］?？傊甇HC底部膜Prestin分布變化，可能是水楊酸鈉導致聽力下降的原因之一，其詳細機制還有待進一步研究。

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The Effects of Sodium Salicylate on the Prestin Distribution in Single Outer Hair Cells of Cochlea Mice

ZHANG Bo，WANG Xian－h(huán)ong，YIN Shi－h(huán)ua
(Department of Otorhinolaryngology，Hubei University of Science and Technology，Xianning Hubei 437100，China)

ObjectiveTo investigate the effects of sodium salicylate on the auditory brainstem response (ABR)thresholds and dynein(Prestin)distribution in outer hair cells of cochlea mice.Methods28 healthy adult mice were randomly divided into four groups.Group A:the saline control group;Group B:the sodium salicylate 4 days group;Group C:the sodium salicylate 8 days group;Group D:the sodium salicylate 16 days group.Sodium salicylate was injected by intraperitoneal injection(200mg/kg·d).Auditory brainstem response thresholds were detected by the United States TDT system.The distribution of prestin was examined by fluorescence microscopy.Results①Auditory function tests showed:the ABR thresholds of group B increased，but the change is not significant when compared with group A(P＞0.05);ABR thresholds of Group C and D were significantly levated，there was a significant difference(P＜0.05)when compared with group A;there was no significant difference between group C and group D(P＞0.05).②fluorescence microscope showed:Group A，the membrane side and bottom of single outer hair cell can be seen clearly prestin antibody staining.B、C、D group，prestin uneven distributed in the outer hair cell membrane，mainly distributed in the side membrane of outer hair cells.Group B，the bottom membrane showed small amount staining.C、D group，the membrane bottom of outer hair cell showed little or no prestin positive staining.ConclusionSodium salicylate induced mice hearing loss may be correlated with prestin abnormal expression in bottom membrane of outer hair cells.

Sodium salicylate;Cochlea;Outer hair cells;Prestin;Mice

R965

A

2095－4646(2015)01－0006－04

2014－10－11)