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        宮頸癌中長鏈非編碼RNA CRNDE表達及其臨床意義

        2015-05-25 05:50:08韓懿勞美瓊雷巧如李艷娜
        中國腫瘤臨床 2015年14期
        關(guān)鍵詞:生存期宮頸癌編碼

        韓懿 勞美瓊 雷巧如 李艷娜

        長鏈非編碼RNA(long non coding RNA,LncRNA)是一類不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA分子。近年來發(fā)現(xiàn)LncRNA與X染色體沉默、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活與抑制、RNA剪切等有關(guān),在胚胎與組織發(fā)育、細胞分化、神經(jīng)代謝性疾病、腫瘤等中發(fā)揮重要功能[1-3]。越來越多的證據(jù)顯示LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,是腫瘤診斷和治療新的研究前沿[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),LncRNA CRNDE(colon rectal neoplasia differentially expressed)在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達明顯升高,提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其生理功能和作用機制尚不明確[6-7]。關(guān)于LncRNA CRNDE在宮頸癌中的功能研究,目前國內(nèi)外相關(guān)報道較少。本研究通過比較LncRNA CRNDE在宮頸癌組織及癌旁組織中表達,分析其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系,為LncRNA CRNDE用于宮頸癌診斷、治療及預(yù)后評估提供理論依據(jù),為尋找新的宮頸癌腫瘤標(biāo)志物提供思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 一般資料 收集2009年10月至2014年10月87例廣東省開平市中心醫(yī)院行手術(shù)切除的宮頸癌患者的癌組織與對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本,所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸癌,標(biāo)本獲取前全部病例均未行化療和放療,臨床資料完整。87例宮頸癌患者的年齡為24~60歲,中位年齡為40歲;年齡<40歲患者為44例,年齡≥40歲為43例;Ⅰ期18例,Ⅱ期22例,Ⅲ期27例,Ⅳ期20例;鱗癌68例,腺癌19例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。65例患者接受了手術(shù),60例患者接受了放化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。

        1.1.2 隨訪 全部患者出院后均進行隨訪,方式為電話和門診隨訪,內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀和影像學(xué)檢查。隨訪起點為病理確診日期,末次隨訪時間為2015年3月31日,截止隨訪終止患者生存41例、死亡46例,無失訪病例。

        1.2 方法

        1.2.1 試劑 Trizol試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、LncRNA CRNDE引物均購自中國上海Invitrigeng公司。

        1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法 收集宮頸癌組織及癌旁組織(50~100 mg)標(biāo)本,放入液氮冷凍后,鋁箔包裹,在研缽中充分研磨,用Trizol試劑反復(fù)洗滌研磨后的碎末,經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理后凍存管收集,放入液氮中,提取RNA進行檢測。在液氮中磨成粉末后,加入1 mL Trizol液研磨(樣品總體積不超過所用Trizol體積10%),移入去RNA酶的EP管中,提取總RNA。取上述準備的RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,在20 μL體系中加2 μg總RNA進行cDNA合成。采用LncRNA CRNDE基因特異性引物CRNDE-FW2及CRNDE-RV2進行RT-PCR,以GAPDH作為內(nèi)參照。LncRNA CRNDE上游引物為5'-GCGGAG GTTAAGTGT-3',下游引物為5'-AACAGGTTTACCTCCT TATCTTCAGAA-3';內(nèi)參照GAPDH上游引物為5'-GGA AGGACTCATGACCACAGTCC-3',下游引物為5'-TCGC TGTI'GAAGTCAGAGGAGACC-3'。比較宮頸癌組織與癌旁組織中LncRNA CRNDE基因表達的變化。實驗重復(fù)3次。LncRNA CRNDE相對表達量(RQ)=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照=(Ct樣品LncRNA CRNDECt樣品GAPDH)-(Ct對照LncRNA CRNDE-Ct對照GAPDH)。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

        采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。宮頸癌組織與癌旁組織中LncRNA CRNDE差異表達采用t檢驗;LncRNA CRNDE表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗。LncRNA CRNDE表達與患者生存期關(guān)系采用Kaplan-Meier法,采用Cox比例風(fēng)險模型用于宮頸癌預(yù)后的多因素分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 LncRNA CRNDE在宮頸癌組織中表達及其與患者的預(yù)后關(guān)系

        RT-PCR檢測LncRNA CRNED在87例宮頸癌組織和癌旁組織中表達,結(jié)果提示LncRNA CRNED在宮頸癌組織中表達為3.974±0.981,明顯高于癌旁組織1.237±0.325,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖1)。

        LncRNA CRNED表達與患者年齡、腫瘤大小、病理類型、腫瘤分化、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤深度等臨床病理特征的關(guān)系見表1。LncRNA CRNED表達與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤深度相關(guān),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而與患者的年齡、腫瘤大小、組織來源和分化程度無關(guān)(P>0.05)。2-ΔΔCt≤1定義為低表達,2-ΔΔCt>1為高表達[8]。

        圖1 LncRNA CRNDE在宮頸癌及癌旁組織中表達Figure1 Expression of LncRNA CRNDE in cervical cancer and paraneo?plastic tissue

        表1 LncRNA CRNDE表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Association between LncRNA CRNDE expression and different clinicopathological features of human cervical cancers

        表1 LncRNA CRNDE表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 (續(xù)表1)Table 1 Association between LncRNA CRNDE expression and different clinicopathological features of human cervical cancers

        2.2 LncRNA CRNDE表達對患者生存期的影響

        采用Kaplan-Meier法分析LncRNA CRNDE表達與患者生存期關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE高表達患者的生存時間較低表達者明顯縮短,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.185,P<0.001,圖2)。

        圖2 LncRNA CRNDE表達水平與患者生存期關(guān)系Figure 2 Correlation between Kaplan-Meier survival curves and Ln?cRNA CRNDE level

        Cox回歸多因素分析發(fā)現(xiàn)FIGO臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤侵潤深度及LncRNA CRNDE表達可作為宮頸癌患者獨立的預(yù)后因子(表2)。

        表2 Cox多因素分析患者的臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系Table 2 Cox multivariate analysis for correlation between clinicopatho?logical features and prognosis in patients

        3 討論

        宮頸癌是全世界婦女中發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤,也是最常見的生殖道惡性腫瘤,嚴重威脅女性健康。近40年來其發(fā)病率卻及死亡率已有明顯下降,但年輕女性宮頸癌的發(fā)病率卻有明顯上升趨勢,已引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。雖然多數(shù)的早期宮頸癌可經(jīng)手術(shù)或放療等手段而治愈,但其中20%~25%病例卻因復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗,因此宮頸癌的預(yù)后也是不容忽視的問題[9-10]。LncRNA是一類不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA分子,可在多層面上(表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達,其功能目前尚不完全清楚[11]。近年來的研究表明,LncRNA以RNA形式在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達,廣泛參與調(diào)控個體的生長發(fā)育以及細胞凋亡、增殖、分化等生命活動,并且還參與了人類癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等病理進程,LncRNA的研究已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的重要熱點[5,12-13]。2011年發(fā)現(xiàn)的LncRNA CRNDE是結(jié)直腸腫瘤差別表達基因,在結(jié)直腸癌以及多種腫瘤組織中表達上調(diào)[14],其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只有較低的編碼蛋白能力,因此將其歸為長鏈非編碼RNA。LncRNA CRNDE定位于16號染色體IRX5基因的反義鏈上,與其共用一個雙向啟動子。LncRNA CRNDE基因全長約10 kb,包含5個核心外顯子和1個出現(xiàn)頻率較低的附加外顯子[15]。該基因存在著多種可變剪接,至少存在十幾種轉(zhuǎn)錄本,其中一些轉(zhuǎn)錄本中存在不同的內(nèi)含子序列。目前研究發(fā)現(xiàn),LncRNA CRNDE在許多癌組織或細胞(實體腫瘤及白血?。┲斜磉_明顯升高,其中在膠質(zhì)瘤中LncRNA CRNDE上調(diào)14~32倍[16]。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNED在宮頸癌組織中表達明顯高于癌旁組織,與LncRNA CRNED在結(jié)直腸癌和腦膠質(zhì)瘤中表達的結(jié)果一致[6,14]。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),LncRNACRNED表達與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤侵潤深度相關(guān),LncRNA CRNDE高表達患者的生存期較低表達者明顯縮短,Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE表達可作為宮頸癌患者獨立的預(yù)后因子。

        總之,本研究將為LncRNA CRNDE應(yīng)用于宮頸癌的診斷、治療及預(yù)后提供理論依據(jù),為尋找宮頸癌腫瘤新的標(biāo)志物提供思路。

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