王琦俠 倪慶仁 戴進前 郭亮 謝佳 任婧婧

近年來，多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的發(fā)病率逐年上升［1］。MM是發(fā)生于終末分化階段B細胞（漿細胞）的惡性淋巴瘤，以骨髓中大量漿細胞克隆性增生為顯著特征。到目前為止，其確切的發(fā)病危險因素仍不清楚，但是既往研究表明，MM的發(fā)生與環(huán)境和遺傳因素均有關(guān)聯(lián)［2］。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染和復(fù)制已被證實是肝癌主要病因之一。隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）是指患者血清中HBsAg陰性卻可用敏感的技術(shù)在其外周血、肝臟等組織中檢測到HBV DNA的存在［3］。最近有一些臨床和流行病學研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可能也是MM發(fā)病的重要危險因素之一［4-6］。然而，既往有關(guān)MM發(fā)病危險因素的研究尚未見有與HBV隱匿性感染相關(guān)的報道。本研究采用病例對照研究方法，通過OBI的檢測和分析，試圖探討HBV隱匿性感染在MM發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

將2010年10月至2014年10月西安市中心醫(yī)院、陜西省人民醫(yī)院、西安市交通大學西北醫(yī)院等5所三級甲等醫(yī)院新發(fā)的MM患者連續(xù)納入病例組。所有患者均依照《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2008）》標準診斷，ISS（international staging system）分期按國際骨髓瘤工作組（IMWG）標準。收集患者完整的實驗室檢查資料，主要包括骨髓穿刺結(jié)果、細胞遺傳學檢測結(jié)果、免疫表型、血常規(guī)、肝腎功能、β2-微球蛋白、血清輕鏈及影像學檢查結(jié)果等。在上述不同醫(yī)院隨機選擇對照組，要求與MM病例組在性別上一致、年齡相差±5歲的同期住院非腫瘤患者。所有研究對象均采集外周血5 mL，分離血清-80℃凍存?zhèn)錂z，并簽署知情同意書。本研究已通過西安市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批。

1.2 檢測方法

1.2.1 外周血HBsAg檢測 HbsAg檢測采用酶聯(lián)免疫法（北京萬泰生物技術(shù)有限公司），具體操作按試劑盒說明書進行。HBsAg結(jié)果判斷：樣品OD值/陰性對照平均OD值≥2.1則判斷為陽性，否則為陰性。

1.2.2 外周血OBI檢測 1）磁珠法提取HBV DNA血清HBsAg陰性者的HBV DNA提取采用磁珠法（長春市志昂生物科技有限公司），具體操作按試劑盒說明書進行。先加入樣本血清200 μL，在King Fisher DUO自動提取儀（美國Thermo Fisher公司）中提取30 min，最終提取產(chǎn)物約45 μL。2）巢式PCR擴增S區(qū)、C區(qū)采用多重巢式PCR法檢測外周血清中HBV DNA基因組中的S區(qū)（S1、S2、S3、S4）、C區(qū)（C1、C2、C3、C4）基因編碼區(qū)片段，擴增引物見表1。巢式PCR分別擴HBV DNA的PCR擴增體系總體積50 μL，包括 23 μL 水，5 μL 10×PCR buffer（含 15 mmol/L Mg?Cl2），4 μL 10 mmol/L dNTP，1.5 μL上、下游引物（S1、S2/C1 和 C2），0.3 μL EX-Taq 酶，和 15 μL DNA 模板。擴增條件為預(yù)變性94℃ 40 s；變性94℃30 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，循環(huán)35次；72℃ 5 min。取第1次PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL進行第2次擴增，反應(yīng)條件與第1次反應(yīng)相同。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。采用HBV DNA陽性血漿和陰性血漿作為對照。判斷標準：S區(qū)和C區(qū)片段擴增均為陽性者，判定為隱匿性HBV 感染［7］。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)使用EpiData軟件建立數(shù)據(jù)庫雙錄入，采用 SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件（SPSS Inc，Chicago，Illi?nois，USA）進行統(tǒng)計學分析。組間率的比較用χ2檢驗或Fisher精確概率法；HBV與MM發(fā)病的關(guān)系分析采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學特征

MM病例組（185例）和對照組（182例）人群在性別、年齡、受教育程度、婚姻狀況及其居住地方面的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05，表2）。

表1 巢式PCR檢測OBI的引物序列Table 1 Primer sequences of nested PCR for OBI detection

表1 巢式PCR檢測OBI的引物序列（續(xù)表1）Table 1 Primer sequences of nested PCR for OBI detection

2.2 HBV感染與MM發(fā)病的關(guān)聯(lián)分析

185例MM患者中HBsAg陽性者15例（8.1%），182例對照組8例（4.4%），兩組間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.58，P＞0.05）；OR 值 為 2.58（95%CI：0.84～4.49），P＜0.05；170例HBsAg陰性的MM患者中OBI感染者6例（3.5%），174例對照組中1例（0.6%），兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；OR值為6.44（95%CI：0.77～64.06），P＜0.05。

將HBsAg陽性者與OBI陽性者合并，MM組HBV感染率為11.35%（21/185），對照組為4.95%（9/182），兩組HBV總感染率存在顯著性差異（χ2=5.02，P＜0.05）。OR值為2.46（95%CI：1.10～5.53），P＜0.05，見表3。

2.3 MM患者感染HBV與否的臨床特征比較

在MM患者中，HBV感染者與未感染者之間在性別和年齡未見有明顯差異（均P＞0.05）；但在ISS分期中，HBV感染者Ⅲ期的比例明顯高于未感染HBV組（85.7%vs.60.4%，χ2=5.15，P＜0.05）。實驗室指標中，血紅蛋白在兩組間未見明顯差異，白蛋白在感染者中較未感染者明顯減低（χ2=5.60，P＜0.05），κ/λ輕鏈比值在感染組也明顯低于未感染組（P＜0.05，表4）。

表2 MM病例組與對照組的均衡性檢驗 n（%）Table 2 Balance test of MM patients(185 cases)and control group(182 cases)

表3 HBV不同感染情況與MM患者發(fā)病的關(guān)系Table 3 Relationship between HBV infection and MM incidence

表4 MM患者中HBV感染的臨床特征 n（%）Table 4 Clinical characteristics of HBV infection in patients with MM

表4 MM患者中HBV感染的臨床特征（續(xù)表4）Table 4 Clinical characteristics of HBV infection in patients with MM

3 討論

MM的病因目前尚無定論。多年來流行病學與臨床研究均表明，MM的發(fā)病和其他腫瘤一樣與諸多危險因素有關(guān)，如腫瘤家族史、肥胖、特殊職業(yè)暴露史、飲食習慣、吸煙、飲酒及染發(fā)等［8-10］，是多病因交互作用所致。最近有一些臨床和流行病學研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可能也是MM發(fā)病重要的危險因素之一［3-5］。但國內(nèi)外一些研究結(jié)果相互矛盾，2012年Becker報道了在歐洲6個國家進行的淋巴瘤多中心病例對照研究，在187例MM患者中，通過檢測HBsAg、抗-HBc和抗-HBs來區(qū)分病例和對照組的HBV當前或過去感染和免疫接種情況，發(fā)現(xiàn)過去曾有HBV感染與MM發(fā)病呈正相關(guān)（OR=1.97，95%CI：1.16～3.37）［5］；在我國2012年也有研究報道發(fā)現(xiàn)MM患者HBsAg陽性率明顯高于急性白血病患者（19.4%vs.12.0%，P=0.014）［11］，提示HBV感染可能在MM發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。王立茹等［12］對363例MM患者進行回顧性研究，血清檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBsAg陽性率顯著高于健康體檢者感染率（4.4%vs.2.4%，P=0.015）；但倪芳等［13］檢測了198例MM患者乙肝五項及HBV-DNA定量，HBsAg陽性率與對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義（2.6%vs.3.4%，P＞0.05）。本研究結(jié)果也顯示，MM患者與對照組HBsAg陽性率之間的差異無統(tǒng)計學意義。但若將HBV隱匿性感染納入分析，結(jié)果則表明MM患者HBV的總感染率明顯高于對照組（P＜0.05），而且感染HBV發(fā)生MM的風險是未感染者的2.46倍（OR=2.46）。

既往研究表明HBV整合于宿主細胞基因組是免疫逃避的機制之一，也是HBV在體內(nèi)長期存在的重要原因。HBV除了能整合于肝細胞，還能整合于外周血免疫細胞之中，并影響細胞功能［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，盡管OBI病毒載量很低（≤100 IU/mL），但可導致細胞DNA損傷、氧化應(yīng)激和凋亡增加［15］。該研究認為OBI的主要機制是由于HBV整合到宿主的基因組中并在外周血單核細胞（PBMC）中持續(xù)存在。OBI對MM發(fā)病的影響在既往的研究中未見報道，本研究結(jié)果提示對研究對象開展OBI檢測可以更加準確地反應(yīng)其HBV感染情況。因此，綜合這些研究結(jié)果說明OBI可能在MM發(fā)病中起著一定的作用，值得深入開展研究。需要指出的是，由于本研究采用的是回顧性的病例對照研究設(shè)計，尚須進一步采用前瞻性研究和實驗研究以驗證HBV隱匿性感染與MM之間的因果關(guān)聯(lián)性。

MM患者中有HBV感染者較未感染者伴有更多細胞遺傳學異常、肝功能異常和較差的生存期［16］。本研究也發(fā)現(xiàn)伴有HBV感染的Ⅲ期MM患者所占比例較高；與此同時，和ISS分期同樣有預(yù)后判斷價值的κ/λ輕鏈比值在HBV感染者較未感染者中減低，亦提示感染者預(yù)后較差［17］。本研究結(jié)果還顯示，伴有HBV感染的MM患者肝臟功能受損，其原因可能是MM的化療中一般都包括糖皮質(zhì)類固醇激素，這可能會導致HBV再激活，加重肝功能的損害，甚至爆發(fā)重癥肝炎而威脅生命。因此，對于已感染HBV的MM患者應(yīng)在化療前開始預(yù)防性應(yīng)用抗病毒復(fù)制的藥物，以有效地預(yù)防HBV再激活［18］，尤其是要對HBsAg陰性的MM患者在化療前也應(yīng)開展OBI的篩查，避免出現(xiàn)HBV再激活而影響生存期。

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Alexander DD,Mink PJ,Adami HO,et al.Multiple myeloma:a review of the epidemiologic literature[J].Int J Cancer,2007,120(Suppl 12):40-61.

[3]Raimondo G,Allain,JP,Brunetto MR,et al.Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infection[J].J Hepatol,2008,49(4):652-657.

[4]Franceschi S,Lise M,Trépo C,et al.Infection with hepatitis B and C viruses and risk of lymphoid malignancies in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition(EPIC)[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2011,20(1):208-214.

[5]Kang J,Cho JH,Suh CW,et al.High prevalence of hepatitis B and hepatitis C virus infections in Korean patients with hemato?poietic malignancies[J].Ann Hematol,2011,90(2):159-164.

[6]Becker N,Schnitzler P,Boffetta P,et al.Hepatitis B virus infec?tion and risk of lymphoma:results of a serological analysis within the European case-control study Epilymph[J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,138(12):1993-2001.

[7]Su HX,Zhang YH,Xu DZ,et al.Occult hepatitis B virus infec?tion in anti-HBs-positive infants born to HBsAg-positive moth?ers in China[J].PloS One,2013,8(8):e70768.

[8]Landgren O,Kristinsson SY,Goldin LR,et al.Risk of plasma cell and lymphoproliferative disorders among 14621 first-degree rela?tives of 4458 patients with monoclonal gammopathy of undeter?mined significance in Sweden[J].Blood,2009,114(4):791-795.

[9]Wallin A,Larsson SC.Body mass index and risk of multiple my?eloma:a meta-analysis of prospective studies[J].Eur J Cancer,2011,47(11):1606-1615.

[10]Wang Q,Wang Y,Ji Z,et al.Risk factors for multiple myeloma:a hospital-based case-control study in Northwest China[J].Cancer Epidemiol,2012,36(5):439-444.

[11]Huang B,Li J,Zhou Z,et al.High prevalence of hepatitis B virus infection in multiple myeloma[J].Leuk Lymphoma,2012,53(2):270-274.

[12]Wang LR,Chen YJ,Li X,et al.A case-control study of hepatitis B virus infection in multiple myeloma patients and healthy con?trols[J].Chin J Clin Oncol,2014,41(13):836-839.[王立茹,陳以娟,李 星,等.乙型肝炎病毒感染率在多發(fā)性骨髓瘤及健康體檢人群的病例對照研究[J].中國腫瘤臨床,2014,41(13):836-839.]

[13]Ni F,Liu YY,Wu ZQ,et al.Multiple myeloma associated with hepatits B virus infection:a clinical observation[J].Chinese Clini?cal Oncology,2013,18(9):804-807.[倪 芳,劉雁雁,吳志奇,等.多發(fā)性骨髓瘤與乙型肝炎病毒感染的臨床觀察[J].臨床腫瘤學雜志,2013,18(9):804-807.]

[14]Tsai WL,Chung RT.Viral hepatocarcinogenesis[J].Oncogene,2010,29(16):2309-2324.

[15]Pollicino T,Vegetti A,Saitta C,et a1.Hepatitis B virus DNA inte?gration in tumour tissue of a non-cirrhotic HFE-haemochroma?tosis patient with hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,2013,58(1):190-193.

[16]Teng CJ,Liu HT,Liu CY,et al.Chronic hepatitis virus infection in patients with multiple myeloma:clinical characteristics and out?comes[J].Clincs,2011,66(12):2055-2061.

[17]Bradwell A,Harding S,Fourrier N,et al.Prognostic utility of in?tact immunoglobulin Ig'κ/Ig'λ ratios in multiple myeloma patients[J].Leukemia,2013,27(1):202-207.

[18]Li J,Huang BH,Li Y,et al.Hepatitis B virus reactivation in pa?tients with multiple myeloma receiving bortezomib-containing regimens followed by autologous stem cell transplant[J].Leuk Lymphoma,2015,14:1-8.