胡威 董忠誼 吳德華

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)HCC發(fā)病人數(shù)約占全球的55%，在腫瘤相關(guān)死亡中高居第2位［1］。研究表明：影響HCC患者生存最主要的因素為術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］。因此尋找肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素及探討其促癌機(jī)制將有助于臨床診療策略的制定及抗腫瘤新藥的開(kāi)發(fā)。近年研究發(fā)現(xiàn)泛素樣蛋白家族成員FAT10參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3-5］，本課題組前期的研究也證實(shí)FAT10在乙肝相關(guān)肝癌中高表達(dá)，且促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移［6］。Rho家族成員RhoA可直接影響細(xì)胞骨架蛋白（F-actin）重構(gòu)，改變細(xì)胞的遷移、侵襲能力［7-8］，是否FAT10促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移通過(guò)RhoA介導(dǎo)尚不明確。本研究擬初步探討FAT10對(duì)細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

病例樣本來(lái)自于2003年3月至2006年10月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者108例（表1）。按照美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)（AJCC）2003年聯(lián)合制定的TNM分期法進(jìn)行臨床分期，所有患者術(shù)前均未接受其他治療手段，術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的診斷主要依據(jù)影像學(xué)和臨床病理活檢證實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將肝癌標(biāo)本組織切片置于65℃烤箱中烘烤2 h，二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化后，PBS沖洗3次（5 min/次），再于3%H2O2室溫孵育10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響；PBS沖洗3次（5 min/次），將組織切片完全浸泡在PH值為6.0的枸櫞酸酸溶液中，高壓修復(fù)3 min，室溫冷卻；PBS沖洗3次（5 min/次），其后分別滴加FAT10（美國(guó)Epitomics公司，1∶100）及active-RhoA（美國(guó)AB?cam公司，1∶100）一抗工作液，4℃過(guò)夜；復(fù)溫40 min防脫片，PBS沖洗3次（5 min/次），滴加二抗工作液（丹麥Dako公司），室溫孵育1.5 h；DAB（丹麥Dako公司）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察，評(píng)分及采圖。

1.2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 由兩位高年資病理醫(yī)師分別對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)判，每個(gè)點(diǎn)隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400），每野計(jì)數(shù)500～1 000個(gè)細(xì)胞。從兩方面進(jìn)行計(jì)分，一方面據(jù)染色強(qiáng)度：無(wú)著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；另一方面據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，76%及以上為4分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘為最終結(jié)果：3分以下為陰性（-），3分為弱陽(yáng)性（+），4分為中陽(yáng)性（++），5分及以上為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）［8］。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)4株肝癌細(xì)胞株7721、HepG2、Huh7及LM3均來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)肝病研究中心。7721細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RP?MI 1640培養(yǎng)液中，其余細(xì)胞株均培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中（試劑及血清均來(lái)自于美國(guó)gibco公司），置于37℃、5%CO2的相對(duì)飽和的培養(yǎng)箱中（美國(guó)Thermo公司）傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.4 質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染

1.2.4.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 肝癌細(xì)胞接種于含10%胎牛的培養(yǎng)基中，置于37℃，含5%CO2飽和培養(yǎng)箱中培育。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備密度為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipo2000試劑盒說(shuō)明操作轉(zhuǎn)染FAT10過(guò)表達(dá)及對(duì)照質(zhì)粒，6 h后更換新鮮含胎牛血清的培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)轉(zhuǎn)染后48 h Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率）。

1.2.4.2 siRNA轉(zhuǎn)染 siRNA干擾 FAT10（NM_006398）基因表達(dá)，干擾序列為：sense 5'-GAGACUA AGACGGGUAUAATT-3'，antisense 5'-UUAUACCCG UCUUAGUCUCTT-3'（上海吉瑪基因公司），嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)用脂質(zhì)體RNA-iMAX轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞（In?vitrogen），肝癌細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前12 h被鋪于6孔板，50 pmolsiRNA或?qū)φ招蛄屑? μL的脂質(zhì)體RNAiMAX被混合于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育20 min，加入6孔板中培養(yǎng)48h備用（實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)轉(zhuǎn)染后48 h Western blot驗(yàn)證干擾效率）。

1.2.5 Western blot分析 用RIPA試劑裂解（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑）以上4株細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將等量（30μg）蛋白質(zhì)的全細(xì)胞裂解液經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，將分離出的蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。印跡膜在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液內(nèi)室溫封閉1 h各自加入兔抗人FAT10（美國(guó)AB?cam公司，1∶5 000稀釋）、total RhoA（美國(guó)ABcam公司，1：500稀釋）及active-RhoA（美國(guó)ABcam公司，1∶500稀釋），ROCK（美國(guó)ABcam公司，1：10 000稀釋）βactin單克隆抗體（美國(guó)ABcam公司，1∶7 500稀釋，作為內(nèi)參），4℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜3次，15 min/次，滴加HRP標(biāo)記的抗兔二抗（美國(guó)ABcam公司，1∶15 000稀釋），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)（美國(guó)Thermo公司）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 免疫熒光 細(xì)胞爬片于4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次（5 min/次），0.25%Trixton通透5 min，PBS漂洗3次（5 min/次），5%BSA封閉50 min，F(xiàn)-action一抗（美國(guó)ABcam公司，1∶50），4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，5 min/次，羊抗兔單克隆熒光二抗（江蘇碧云天生物技術(shù)公司，1∶100）孵育1.5 h，正置熒光顯微鏡觀察F-actin變化并采圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。RhoA及FAT10與患者臨床特征間的相關(guān)性，及二者間的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，不同分組資料的生存分析采用K-M生存分析法進(jìn)行，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 active-RhoA及FAT10同HCC患者轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示active-RhoA蛋白表達(dá)水平同HCC轉(zhuǎn)移（P=0.036）及復(fù)發(fā)（P=0.026）密切相關(guān)，F(xiàn)AT10蛋白表達(dá)亦同HCC轉(zhuǎn)移（P=0.031）及復(fù)發(fā)（P=0.004）密切相關(guān)（表1）；FAT10高表達(dá)者預(yù)后明顯差于低表達(dá)者（P=0.026），active-RhoA高表達(dá)患者預(yù)后亦明顯差于低表達(dá)者（P=0.019，圖1）。

2.2 FAT10與active-RhoA相關(guān)性

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示FAT10同active-RhoA表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)（P＜0.001，表2）；且active-Ro?hA與FAT10存在共定位（圖2）。

2.3 FAT10促進(jìn)活化型RhoA的表達(dá)

在FAT10過(guò)表達(dá)細(xì)胞株7721及HepG2中，active-RhoA及ROCK蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（圖3）；在FAT10干擾的細(xì)胞株Huh7、LM3中active-RhoA及ROCK蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（均P＜0.01）。

2.4 7721細(xì)胞過(guò)表達(dá)FAT10后細(xì)胞骨架蛋白FAT10的變化

對(duì)照組肝癌細(xì)胞株7721 F-actin表達(dá)較弱，細(xì)胞膜染色不連續(xù)，胞質(zhì)中蛋白表達(dá)呈云絮狀，過(guò)表達(dá)FAT10后細(xì)胞漿內(nèi)F-actin熒光表達(dá)較弱，膜熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)，形態(tài)連續(xù)均勻（圖4）。

表1 108例肝癌患者臨床資料和active-RhoA及FAT10表達(dá)相關(guān)性分析Table 1 Clinical characteristics of 108 HCC patients and their correlation with active-RhoA and FAT protein expression level

圖1 108例來(lái)自于不同active-RohA和FAT10分組HCC患者的生存分析Figure 1 Survival analysis of 108 HCC patients from different active-RhoA and FAT10 groups

表2 FAT10同active-RhoA間相關(guān)性分析Table 2 Correlation between FAT10 and active-RhoA

圖2 FAT10與active-RhoA的免疫組化共定位（IHC×400）Figure 2 Co-location of FAT10 and active-RhoA by IHC（IHC×400）

圖3 Western blot檢測(cè)不同HCC細(xì)胞株過(guò)表達(dá)/干擾FAT10后RhoA/ROCK蛋白水平的變化（n=3）Figure 3 Western blot showed changes in RhoA and ROCK in different HCC cells after overexpression or interference of FAT10(n=3)

圖4 采用免疫熒光檢測(cè)過(guò)表達(dá)FAT10的7721細(xì)胞骨架蛋白F-actin（×400）Figure 4 F-actin of 7721 cells detected by immunofluoresence after FAT10 overexpression（×400）

3 討論

FAT10位于人Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體染色體位點(diǎn)中，屬泛素樣蛋白家族［5］，目前鑒定的泛素樣家族成員主要有：NEDD8、SUMO、ISG15、ATG8、ATG12和URM1，這一家族蛋白參與細(xì)胞分化、DNA損傷修復(fù)、自噬、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胚胎發(fā)育等多種重要的細(xì)胞生命活動(dòng)，無(wú)疑FAT10紊亂會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。目前已證實(shí)，F(xiàn)AT10在直腸癌、胃癌和婦科腫瘤中明顯高表達(dá)［9-13］，在肝癌中的高表達(dá)率甚至達(dá)90%［14］；對(duì)藥物誘導(dǎo)性肝癌的研究表明FAT10參與肝臟癌前病變及腫瘤的形成［15-16］；分子機(jī)制探討則表明：FAT10是p53重要的下游靶基因，在p53缺陷細(xì)胞中FAT10的異常表達(dá)可能直接導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而且FAT10還可在有絲分裂期間非共價(jià)結(jié)合許多腫瘤中共有的紡錘體檢測(cè)點(diǎn)蛋白MAD2，導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降，致惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展［17］；本研究及南昌大學(xué) 邵 江 華等闡明：FAT10 可通過(guò) Akt/GSK3β/βcatenin通路或直接作用于β-catenin促進(jìn)肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移［8，18］。本研究證實(shí)：FAT10同HCC患者侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且FAT10高表達(dá)患者預(yù)后明顯差于FAT10低表達(dá)患者，進(jìn)一步明確了FAT10在肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，也為其在肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)及評(píng)估中的價(jià)值提供了新的依據(jù)。

RhoA屬于小G蛋白R(shí)ho家族的重要成員，在細(xì)胞骨架蛋白（F-actin）重構(gòu)的調(diào)控中具有重要作用，參與細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、黏附及遷移運(yùn)動(dòng)等多種生物學(xué)過(guò)程［3-4］。多種惡性腫瘤如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中存在RhoA的高表達(dá)［18］，且其表達(dá)水平與乳腺癌的組織病理分級(jí)和淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，可作為乳腺癌重要的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)［19］；靜息時(shí)，RhoA位于細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞受外因刺激時(shí)，RhoA被激活并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，活化的RhoA作用于下游效應(yīng)蛋白R(shí)ho相關(guān)激酶（Rho associated kinase，ROCK）或inDia，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)，促腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［20］，乳腺癌研究證實(shí)靶向RhoA的miRNA-133可抑制RhoA蛋白的表達(dá)并抑制癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移［21］。上述研究均提示了RhoA在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的重要作用，但是否FAT10促進(jìn)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移由RhoA介導(dǎo)，尚不明確，本研究結(jié)果顯示：active-RhoA高表達(dá)患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)者；且FAT10的表達(dá)同active-RhoA密切相關(guān)，二者存在一致的共定位。Western blot檢測(cè)的結(jié)果亦表明：過(guò)表達(dá)FAT10促進(jìn)肝癌細(xì)胞株active-RhoA及其下游細(xì)胞骨架調(diào)控分子Rock的表達(dá)，干擾FAT10則抑制活化型RhoA及ROCK蛋白的表達(dá)。這提示FAT10影響肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移可能通過(guò)其作用于RhoA并活化RhoA-ROCK通路介導(dǎo)F-actin是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在細(xì)胞侵襲遷移中起著重要的支架作用［4］。既往研究均缺乏FAT10作用于F-actin的直接證據(jù)，本研究免疫熒光的結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)FAT10促進(jìn)肝癌細(xì)胞株7721 F-actin的表達(dá)，并且使F-actin連續(xù)表達(dá)于肝癌細(xì)胞膜，這為FAT10促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移提供了物質(zhì)可能。

綜合本課題組已發(fā)表的數(shù)據(jù)及上述試驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)AT10可作為HCC預(yù)后預(yù)測(cè)較有潛力的指標(biāo)；且FAT10影響HCC侵襲、轉(zhuǎn)移可能通過(guò)增加活化型RhoA，及其下游效應(yīng)蛋白R(shí)OCK的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)和分布來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，本課題組及其他學(xué)者研究證實(shí)FAT10可直接作用于βcatenin介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，且有報(bào)道認(rèn)為β-catenin對(duì)RhoA-ROCK通路亦存在一定的調(diào)控作用［22-23］，因此推測(cè)FAT促肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用可能通過(guò)直接作用于β-catenin進(jìn)而活化RhoA-ROCK通路，但目前缺乏直接的證據(jù)，有待進(jìn)一步研究。

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