李欣，武文卿，張卓超，俎占飛，毛旭燕，朱恒 ，寧守斌*

1.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院消化科，北京 100142;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院科技部，北京 100850;3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組發(fā)病原因尚不明確的慢性非特異性的炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，其發(fā)生發(fā)展與遺傳易感性、外部環(huán)境、感染介質(zhì)、腸道共生菌及免疫系統(tǒng)的功能障礙等多因素相互作用有關(guān)［1］，主要臨床癥狀為腹痛、腹瀉、粘液膿血便、體重減輕，長(zhǎng)期發(fā)展亦有癌變的風(fēng)險(xiǎn)［2］，因此IBD相關(guān)研究日益受到重視。采用動(dòng)物模型開(kāi)展研究具有受倫理學(xué)限制少，便于取材等優(yōu)勢(shì)。目前常用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)溶于水中給予小鼠飲用建立IBD模型，其病理改變與人臨床病理改變接近［3］。但是，不同研究小組建立DSS誘導(dǎo)的 IBD模型的方法并不統(tǒng)一，所用小鼠周齡(4～16周)、小鼠品系(KM、BALB/c、C57BL/6和 C57BL/10等)、DSS濃度(2% ～10%)和自由飲水時(shí)間(5～10 d)等多個(gè)因素均不相同，成模率也高低不等，這些不利于利用動(dòng)物模型開(kāi)展炎癥性腸病的研究。

我們?cè)诖罅空{(diào)研文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)采用不同濃度的DSS溶液自由飲用以建立炎癥性腸病C57小鼠模型，系統(tǒng)探討DSS濃度對(duì)IBD成模率和動(dòng)物死亡率及致病相關(guān)免疫因子表達(dá)的影響，以期篩選出成模穩(wěn)定、可操作性好、成模率高的模型，從而為IBD的治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠64只，19～21 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供［SCXK:(京)2012－0001］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所號(hào)為SYXK－軍2012－0065。喂養(yǎng)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d。DSS購(gòu)自默克公司，相對(duì)分子質(zhì)量為36×103～50×103白色粉末狀固體，DSS與去離子水分別配置濃度為3%、5%、7%的DSS水溶液。

1.2 動(dòng)物分組

對(duì)照組(n=16):自由飲水組;實(shí)驗(yàn)－1組(n=16):3%－DSS 溶液組;實(shí)驗(yàn)－2 組(n=16):5%DSS 溶液;實(shí)驗(yàn)－3組(n=16):7%DSS溶液組。

1.3 DSS誘導(dǎo)小鼠IBD模型制備

小鼠自由飲用3%、5%、7%DSS溶液，建立IBD模型，新鮮的DSS溶液每隔1 d更換1次，正常對(duì)照組小鼠飲用去離子水。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 一般指標(biāo)

觀察小鼠大便性狀、體重改變和生存情況。

1.4.2 小鼠結(jié)腸組織大體觀察及評(píng)分

DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型其結(jié)腸大體病理改變主要為結(jié)腸縮短和水腫，Egger等研究發(fā)現(xiàn)IBD小鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度變化可以用來(lái)評(píng)價(jià)炎癥嚴(yán)重程度。模型建立的第6天處死小鼠，取出結(jié)腸部分，觀察結(jié)腸的大體形態(tài)，測(cè)量肛門(mén)至盲腸末端的長(zhǎng)度。病理評(píng)分按照Morris［4］的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行:0分:基本正常;1分局部充血，未見(jiàn)潰瘍;2分無(wú)充血，有潰瘍;3分:潰瘍和炎癥僅有1處;4分:有兩處以上的潰瘍和炎癥;5分:潰瘍長(zhǎng)度大于2 cm;6～10分:大于2 cm的潰瘍，每增加1 cm多計(jì)1分。

1.4.3 小鼠結(jié)腸組織學(xué)觀察及評(píng)分

隨機(jī)取含病變腸組織并去除腸內(nèi)容物，以4%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，行蘇木素伊紅(HE)染色。組織學(xué)評(píng)分按照Scheiffele等［5］的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行:0分:無(wú)顯著炎癥;1分:僅見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(高倍視野，≤10%)，其無(wú)腸壁結(jié)構(gòu)改變:2分:中等數(shù)量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(高倍視野，10% ～25%)，腸壁增厚，腸隱窩變長(zhǎng)，但無(wú)透過(guò)黏膜層的潰瘍;3分:顯著的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(高倍視野，25% ～50%)，腸壁增厚，血管密度增加:4分:腸壁內(nèi)可見(jiàn)大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)全層(高倍視野，≥50%)，腸隱窩變長(zhǎng)并扭曲，有潰瘍形成，腸壁全層增厚，血管密度增加。

1.4.4 小鼠脾細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)檢測(cè)

建模后6 d處死小鼠，解剖取脾，收集脾細(xì)胞，Trizol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系按照試劑盒說(shuō)明配置，RT－PCR檢測(cè)促炎因子(TNF－α、IFN－γ 和 IL－17A)，抑炎因子(IL－4 和 IL－10)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠飲水狀況(見(jiàn)表1)

表1 各組小鼠飲水量(n=16)Tab.1 The drinking amount of the mice in each group

2.2 小鼠一般狀況

對(duì)照組小鼠精神活躍，大便性狀正常，毛發(fā)光澤好且順滑。

3%DSS組小鼠造模后精神稍差，多為半稀便，少許粘肛，可見(jiàn)輕微的肉眼血便。

5%DSS組小鼠造模后精神差、懶惰，肉眼血便，飲食減少，部分小鼠出現(xiàn)豎毛、弓背現(xiàn)象。

7%DSS組小鼠造模后精神倦怠，懶惰，拱背，扎堆，毛發(fā)無(wú)光澤、豎毛現(xiàn)象，可見(jiàn)明顯肉眼純稀血便。

2.3 小鼠體重變化

各組小鼠自由飲用不同濃度的DSS溶液后體重變化(見(jiàn)圖1)。

對(duì)照組小鼠體重持續(xù)增加，實(shí)驗(yàn)組小鼠DSS(3%、5%、7%)組前3 d體重均緩慢增加，4 d體重迅速下降，且隨著DSS濃度的增加小鼠體重下降幅度越大。第6天時(shí)，3%DSS、5%DSS、7%DSS 飲用組的小鼠體重降低百分率分別為16.26%、17.95%、20.62%。

圖1 各組小鼠體重改變Fig.1 Changes of body weight of the mice in each group

2.4 結(jié)腸大體病理學(xué)觀察

各組小鼠結(jié)腸肉眼大體形態(tài)觀見(jiàn)(圖2)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比結(jié)腸明顯縮短。進(jìn)一步觀察可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠結(jié)腸腸壁較薄，顏色紅潤(rùn)，褶皺清晰;3%DSS組小鼠腸壁水腫，褶皺變淺，輕微充血;5%DSS組小鼠腸腔充血水腫，可見(jiàn)潰瘍，伴有少量壞死;7%DSS組小鼠腸腔可見(jiàn)明顯潰瘍，伴有大面積壞死，局部腸壁增厚，腸腔狹窄。

大體形態(tài)學(xué)和組織學(xué)評(píng)分結(jié)果如(表2)所示，可見(jiàn)隨著飲用的DSS溶液濃度的提升，小鼠結(jié)腸的大體病理?yè)p害逐漸加重。

表2 炎癥性腸病小鼠結(jié)腸評(píng)分(，n=16)Tab.2 The scores of IBD colons

表2 炎癥性腸病小鼠結(jié)腸評(píng)分(，n=16)Tab.2 The scores of IBD colons

組別Groups成模率/%Modeling success rate對(duì)照組Control Group 0.0 0.0 03%DSS組3%DSS Group 3.54±0.07 2.53±0.38 1005%DSS組5%DSS Group 4.46±0.09 3.61±0.08 1007%DSS組大體評(píng)分General scores病理評(píng)分Pathologic scores 7%DSS Group 6.73±0.21 4.64±0.06 100

2.5 組織病理學(xué)觀察

組織病理學(xué)的HE染色結(jié)果(如圖3)示，對(duì)照組小鼠腸黏膜層、肌層和腸腺體結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)完整;3%DSS組小鼠腸壁增厚，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層和肌層結(jié)構(gòu)不清，腸腺體結(jié)構(gòu)消失;5%DSS組小鼠腸壁水腫增厚更加明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);7%DSS組小鼠除了具有前述表現(xiàn)外，可見(jiàn)腸黏膜壞死脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至全層。

2.6 IBD發(fā)病相關(guān)免疫因子的表達(dá)情況

如圖4所示，定量 PCR結(jié)果表明促炎因子(TNF－α、IFN－γ 和 IL－17A)的表達(dá)水平與 DSS 濃度成正相關(guān)，而抑炎因子(IL－4和IL－10)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)水平與DSS濃度成負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖2 各組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)觀Fig.2 Gross appearance of the colon in the mice

圖3 各組小鼠組織病理分析Fig.3 Histological analysis of the colon in the mice of each groupe.Bar=100 μm

圖4 各組免疫分子mRNA相對(duì)表達(dá)量(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.4 The relative mRNA levels of immune factors in the mice of each group(*，P ＜0.05;＊＊，P ＜0.01).

2.7 各組小鼠生存率

建模第6天時(shí)，飲用不同濃度DSS的小鼠的病理表現(xiàn)均表現(xiàn)為典型的炎性腸病損害。但是，各組小鼠的死亡率出現(xiàn)差異，分別為:3%組為18.2%，5%組為33.3%，7%組為50%，以7%組的死亡率分別和3%組以及5%組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這種差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)(P＜0.05)。

圖5 各組小鼠存活百分率Fig.5 Survival curves of the mice in each group

3 討論

IBD的發(fā)病機(jī)制至今尚無(wú)定論，現(xiàn)認(rèn)為可能與環(huán)境、遺傳、微生物感染及免疫等多種因素有關(guān)，其中，免疫因素在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中尤為重要［6］。目前常用的模擬人類IBD的動(dòng)物模型采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)制備，DSS是一種硫酸多聚糖，由蔗糖合成而來(lái)，其具有和肝素相似的抗凝血作用。DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎發(fā)生的具體機(jī)制不詳，可能和其導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)、DSS對(duì)結(jié)腸上皮的毒性作用以及巨噬細(xì)胞功能失調(diào)有關(guān)，也可能與DSS促進(jìn)炎性細(xì)胞因子 TNF－α/、IFN－γ、IL－17A 等的表達(dá)及與嗜酸性細(xì)胞脫顆粒有關(guān)［7］。DSS誘導(dǎo)炎癥性腸病模型簡(jiǎn)單易行，成功率高，重復(fù)性好，其癥狀、結(jié)腸肉眼病變和組織學(xué)改變均與人類IBD相似，且可人為地反復(fù)以DSS刺激，產(chǎn)生與人類IBD急性期和緩解期相似的病理改變［8］，是研究IBD發(fā)病機(jī)制和藥物療效比較合適的動(dòng)物模型。

多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，DSS－IBD模型的建立主要受動(dòng)物種系、DSS濃度，DSS相對(duì)分子質(zhì)量，DSS暴露時(shí)間等因素的影響［9］。其中DSS濃度對(duì)模型的成功建立起著決定性的作用。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展C57BL/6小鼠自由飲用去離子水、3%、5%、7%相對(duì)分子質(zhì)量為36000～50000 DSS溶液造模實(shí)驗(yàn)，主要目的是探索最佳造模濃度和時(shí)間及探討不同濃度的DSS對(duì)小鼠炎癥因子表達(dá)的影響。通過(guò)開(kāi)展本研究，我們篩選出了既能獲得典型病理改變，又不犧牲過(guò)多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的合理DSS給藥濃度，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和動(dòng)物倫理學(xué)價(jià)值。

在IBD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中炎癥細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)起著重要的作用，測(cè)定細(xì)胞因子 TNF－α、IFN－γ、IL－17A、IL－4、IL－10 以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)水平的水平可反映IBD的病情變化，同時(shí)也便于開(kāi)展深入的發(fā)病機(jī)制研究。以往研究表明，TNF－α、IFN－γ和IL－17A具有廣泛的生物學(xué)活性，在IBD中起到促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用［10］。TNF－α主要由活化的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TNF－α可誘導(dǎo)趨化因子，促使中性粒細(xì)胞遷移到腸道的炎癥區(qū)域，也可以釋放血小板活化因子，促進(jìn)一氧化氮、白三烯釋放，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子，誘導(dǎo)血栓生成，引發(fā)腸黏膜血液循環(huán)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致腸道的黏膜組織廣泛性損傷［11］。IFN－γ是由NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生的一種同二聚體糖蛋白，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠強(qiáng)有力的激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而引起腸道炎癥反應(yīng)［12］。Th17細(xì)胞亞群分泌的IL－17A可增加細(xì)胞滲透性，促進(jìn)多種趨化因子和炎癥因子釋放，與其他炎癥因子一起發(fā)揮協(xié)同作用，放大其在IBD的致炎作用。而IL－4、IL－10以及Treg細(xì)胞起到抑制IBD發(fā)生的作用。Treg細(xì)胞有預(yù)防和減輕各種炎癥反應(yīng)的作用，在介導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用［13］。IL－10又名細(xì)胞因子合成抑制因子，主要免疫調(diào)節(jié)作用是抑制激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、T細(xì)胞發(fā)揮有效功能。IL－10是一種重要的細(xì)胞因子合成抑制因子在黏膜免疫中可抑制激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞發(fā)揮功能從而起到穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境的作用［14，15］。IL－4 則可通過(guò)抑制 Th1 細(xì)胞的增殖功能進(jìn)而抑制腸道炎癥的發(fā)生［16］。在本研究中，不同濃度的DSS溶液誘導(dǎo)的IBD模型小鼠，各組炎癥因子表達(dá)存在明顯的劑量相關(guān)性，隨著DSS濃度的增加，促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增加而抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也為探索IBD中免疫因子的作用提供了寶貴線索。

綜上所述，本研究經(jīng)濟(jì)高效地建立了DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型，探討了DSS濃度與IBD致病相關(guān)免疫因子的相關(guān)性，相關(guān)研究結(jié)果為開(kāi)展IBD發(fā)病機(jī)制研究以及尋找有效的IBD治療策略提供了有力工具。

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