許果,趙興吉,向小勇,王繼相,佘凱
(1.四川綿陽四0四醫(yī)院胸心外科,四川 綿陽 621000;2.重慶市急救醫(yī)療中心胸心外科,重慶 400014;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科,重慶 400016)
肺切除是臨床上治療肺部疾病的一種重要手段,隨著肺癌和肺結(jié)核發(fā)病率的增加,以及治療手段的進(jìn)步,全肺切除的比例有所增加[1,2]?,F(xiàn)有關(guān)全肺切除的研究主要是圍手術(shù)期處理,對術(shù)后遠(yuǎn)期療效的評價缺乏病理學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過切除大鼠左全肺建立動物模型,以模擬臨床全肺切除術(shù)后的病理生理改變,了解遠(yuǎn)期是否發(fā)生肺血管重塑和肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH),探討肺血管重塑可能的機(jī)制。
SPF級雄性 SD大鼠24只,2~3月齡,體重(248±26)g,購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(渝)2007-0001]。實(shí)驗(yàn)場地由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SYXK(渝)2007-0001]。隨機(jī)分為2組:實(shí)驗(yàn)組12只,行左全肺切除;對照組12只,行假手術(shù)。術(shù)后飼養(yǎng)l2周。
1.2.1 動物模型的建立
3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,行氣管切開,置入自制氣管導(dǎo)管,接小動物呼吸機(jī)。沿左胸第五肋間進(jìn)入胸腔,切除左全肺。對照組麻醉同前,切口至壁層胸膜后,保持其完整,不入胸腔,縫合切口。
1.2.2 肺動脈壓力測定
采用右心導(dǎo)管法測定平均肺動脈壓(mPAP)。
1.2.3 動脈血氧分壓(PaO2)測定
從左心室抽血,用于測定PaO2。
1.2.4 電鏡標(biāo)本制備及觀察
切除右肺,從外周部位及肺門水平切取2~3塊1~2 mm組織塊,處理后在電鏡下觀察肺腺泡內(nèi)動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的大小、形態(tài)、排列形式、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化、表型的轉(zhuǎn)化等。
1.2.5 光鏡標(biāo)本制備及觀察
肺組織標(biāo)本用4%中性甲醛固定,用石蠟包埋,沿右肺門橫斷取材,分別作HE及免疫組化染色。
(1)三型肺小血管不同肌化程度百分比的測定:在400倍光鏡下,觀察并計(jì)數(shù)肺小血管(15 μm<直徑≤200 μm)中肌型動脈(muscularized artery,MA)、部分肌型動脈(partially muscularized artery,PMA)及非肌型動脈(non-muscularized artery,NMA)的數(shù)目,分別計(jì)算它們各占肺小血管總數(shù)的百分比,反映肺小血管的肌化程度。每例標(biāo)本觀測10個血管。
(2)肺中、小型動脈相對中膜厚度及面積的測定:應(yīng)用Mias圖像分析系統(tǒng)測取動脈外徑、中膜厚度(media thickness of vessel,MTV)、血管總面積及中膜面積(media area of vessel,MAV),分別計(jì)算中膜厚度與動脈外徑的比值(MTV%),中膜面積與血管總面積的比值(MAV%),作為肺血管重塑的指標(biāo)。每只大鼠各測量10個肺中型動脈(100 μm <直徑≤200 μm)和肺小型動脈(15 μm <直徑≤100 μm)上述各值,并求其均值。
1.2.6 肺組織免疫組織化學(xué)染色SABC法
操作按試劑盒說明進(jìn)行。
1.2.7 圖像分析
對免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度進(jìn)行測量,每張切片均測量其背景灰度,以消除切片間的誤差。用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)心肺血管分析軟件測取所選血管管壁陽性染色積分光密度(integrated optical density,IOD)作為肺動脈管壁 VEGF和 HIF-1α的相對含量。
采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,統(tǒng)計(jì)方法采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行直線相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)組mPAP(31.91±1.98 mmHg)明顯高于對照組(17.82±1.94 mmHg),PaO2(77.46±5.36 mmHg)明顯低于對照組(90.39±6.02 mmHg),(P<0.01)。
實(shí)驗(yàn)組肺小血管中MA%和PMA%(22.50±4.52,23.33±4.92)明顯高于對照組(13.33±4.92,14.17±5.15)(P<0.01),NMA%(54.17±5.15)明顯低于對照組(72.50±7.54)(P<0.01)。
HE染色顯示對照組的肺小血管管壁較薄,內(nèi)膜光滑,管腔較大,平滑肌細(xì)胞走行一致(圖1)。而實(shí)驗(yàn)組肺小血管收縮,管壁增厚,管腔狹窄、肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖(圖2)。圖像分析表明,實(shí)驗(yàn)組大鼠肺中、小型動脈 MTV、MAV、MTV%和MAV%明顯高于對照組(P<0.01)(表1、2)。
電鏡觀察到對照組肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞胞體扁平,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常。實(shí)驗(yàn)組肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞體積增大,基底變窄,呈柱狀突入管腔,細(xì)胞器豐富,甚至見內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,胞質(zhì)內(nèi)大量空泡形成。對照組中膜平滑肌細(xì)胞胞體小,平滑肌細(xì)胞呈收縮表型。實(shí)驗(yàn)組中膜平滑肌細(xì)胞數(shù)量增多,胞體肥大,細(xì)胞器增多,不同程度向合成表型轉(zhuǎn)化。平滑肌細(xì)胞間及肺間質(zhì)見膠原纖維密集,細(xì)胞外基質(zhì)增多(圖3~5)。
經(jīng)灰度掃描,實(shí)驗(yàn)組肺動脈壁VEGF及HIF-1α的IOD值(42.04±3.79,26.47±4.16)明顯高于對照組(11.53±2.29,6.12±2.14)(P <0.01)。相關(guān)分析表明,VEGF及 HIF-1α陽性染色強(qiáng)度與 PaO2呈負(fù)相關(guān)(r= -0.734,r= -0.712)(P <0.01),與肺小動脈MTV%(r=0.672,r=0.657)(P<0.05)及MAV%(r=0.718,r=0.684)(P < 0.01,P <0.05)呈正相關(guān),HIF-1α與VEGF的陽性染色強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.627)(P<0.05)。
表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠肺中動脈外徑、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.1 Changes of the external diameter,media thickness of vessel,MTV% ,total vascular area,media area of vessel,and MAV%of the median pulmonary arteries in rats of the two groups
表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠肺中動脈外徑、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.1 Changes of the external diameter,media thickness of vessel,MTV% ,total vascular area,media area of vessel,and MAV%of the median pulmonary arteries in rats of the two groups
注:*P<0.01,同對照組比較。Note.*P<0.01,compared with the control group.
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表2 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠肺小動脈外經(jīng)、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.2 Changes of external diameter,media thickness of vessel,MTV% ,total vascular area,media area of vessel,MAV%of small pulmonary arteries in rats of the two groups
表2 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠肺小動脈外經(jīng)、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.2 Changes of external diameter,media thickness of vessel,MTV% ,total vascular area,media area of vessel,MAV%of small pulmonary arteries in rats of the two groups
注:*P<0.01,同對照組比較。Note.*P<0.01,compared with the control group.
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導(dǎo)致PH的病因復(fù)雜多樣,既往許多學(xué)者用多種動物和不同的方法建立過PH動物模型,以模擬不同的發(fā)病因素。如利用大動物建立體-肺分流[3-5],經(jīng)頸部動靜脈血管吻合,用探針穿破主動脈-下腔靜脈[6],給大鼠注射野百合堿(monocrotaline,MCT),導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮損傷,從而形成 PH[7],以及降低氧濃度來誘發(fā)PH[8]等。這些模型都存在不同的局限性,并且不能模擬外科全肺切除后病人的病理生理改變。
圖1 對照組大鼠肺小動脈(HE染色×100)Fig.1 A small pulmonary artery of a control rat.HE staining,×100
圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠肺小動脈(HE染色×100)Fig.2 A small pulmonary artery of an experimental rat.HE staining,×100
圖3 對照組:肺血管內(nèi)皮細(xì)胞胞體扁平,結(jié)構(gòu)正常(×8000)Fig.3 Control group:endothelial cells of the pulmonary artery are flat,the structures are normal. ×8000
圖4 實(shí)驗(yàn)組:肺腺泡內(nèi)動脈內(nèi)皮細(xì)胞呈高柱狀,突入管腔(×8000)Fig.4 Experimental group:endothelial cells of an intra-alveolar pulmonary artery are cubic. ×8000
圖5 實(shí)驗(yàn)組:間質(zhì)膠原纖維堆積(×5000)Fig.5 Experimental group:increase of interstitial collagen fibers.×5000
我們采取左全肺切除方法建立的動物模型,術(shù)后12周測得mPAP明顯升高,表明PH動物模型建立成功。光鏡和電鏡檢查下的病理改變導(dǎo)致肺血管橫截面積顯著增加,肺循環(huán)阻力持續(xù)升高,與文獻(xiàn)報(bào)道的肺動脈高壓組織學(xué)改變是一致的,表明實(shí)驗(yàn)動脈發(fā)生了肺血管重塑,導(dǎo)致PH行成。
在該模型中,除行肺切除外,未施加其他干預(yù)措施,觀察時間較長,能較準(zhǔn)確地模擬臨床全肺切除術(shù)后的病理生理改變。由于大鼠體積小、價格低廉,該方法手術(shù)操作簡單,不需吻合血管,單人肉眼即可完成,也不需要顯微鏡等特殊器械,避免了許多精細(xì)復(fù)雜的操作和吻合口出血、梗阻、狹窄等主要并發(fā)癥,手術(shù)過程相對簡單,動物存活率高,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。因此,本模型在PH的研究中有應(yīng)用價值,為進(jìn)一步研究肺血管重塑和PH的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而探索干預(yù)途徑提供了實(shí)驗(yàn)平臺。
HIF-l是一種轉(zhuǎn)錄因子,由α和β兩個蛋白亞基組成,HIF-1α多肽鏈?zhǔn)俏┮坏难跽{(diào)節(jié)亞單位,它決定HIF-1的活性。HIF-1α是細(xì)胞最早感受缺氧刺激的因子之一。常氧條件下HIF-1無DNA結(jié)合活性,而在低氧條件下其表達(dá)顯著升高[9,10]。本研究中檢測到實(shí)驗(yàn)組大鼠存在慢性低氧血癥,在其肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞和支氣管內(nèi)皮細(xì)胞等處有明顯的HIF-1α免疫陽性表達(dá)。說明由于大鼠左肺切除導(dǎo)致的低氧血癥刺激誘導(dǎo)了肺內(nèi)HIF-1α表達(dá)增加。HIF-1α可誘導(dǎo)大量與低氧應(yīng)答有關(guān)的下游目的基因的表達(dá),如 VEGF、EPO、iNOS 等[11,12]。在這些細(xì)胞因子作用下,血管平滑肌細(xì)胞(PASMC)大量增殖,使血管中膜增厚和非肌性血管肌化,血管腔變窄,同時PASMC合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)增多,使肺血管彈性回縮力和順應(yīng)性降低,血流阻力增加,促進(jìn)PH形成[13,14]。這與本研究中觀察到的病理改變是一致的。
VEGF是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素,肺是體內(nèi)VEGF最大的來源。VEGF的主要生物學(xué)功能是與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的生長,合成和分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)[15]。近年還發(fā)現(xiàn)其增強(qiáng)血管尤其是微小血管的滲透性,使纖維蛋白原等大分子血漿蛋白外滲沉積在血管外的基質(zhì)中。
VEGF基因表達(dá)受多種細(xì)胞因子調(diào)控,其中低氧導(dǎo)致的VEGF表達(dá)主要是通過HIF-1實(shí)現(xiàn)的[16]。在低氧情況下,HIF-1增加了VEGF的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和VEGF mRNA的穩(wěn)定性。低氧刺激還引起血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上與VEGF結(jié)合的受體表達(dá)明顯增多,從而增加VEGF的生物效應(yīng)[17]。在本研究中可見到低氧條件下EVGF在實(shí)驗(yàn)組大鼠肺動脈壁、肺間質(zhì)等處明顯的免疫陽性表達(dá)。而重要的是,HIF-1α與VEGF的陽性表達(dá)呈正相關(guān)。
結(jié)合本研究我們發(fā)現(xiàn),低氧血癥是大鼠左全肺切除后肺血管重建的重要因素。當(dāng)?shù)脱醮碳ねㄟ^血流到達(dá)血管壁時,引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分泌功能和細(xì)胞骨架的改變,誘導(dǎo)合成和分泌HIF-1α 及VEGF 增加,通過 HIF-1α-VEGF 途徑參與了低氧性肺血管重建過程。
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