張俊，Yong－Seong Shin，胡安君，杜芳芳，李永亮，王學(xué)兵，，張紅英，*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450000;2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000)

抗癌藥環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)是臨床上廣泛應(yīng)用的烷化劑類化療藥物之一，由于其高度且廣譜的細(xì)胞毒性作用，除了用于治療急慢性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤，也常常被用作免疫抑制藥，例如在骨髓移植時(shí)的免疫抑制治療以及治療一些自身免疫性疾?。?－2］。但是研究表明，環(huán)磷酰胺作用于機(jī)體的機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的，往往不同劑量，不同作用時(shí)間，會(huì)引起機(jī)體免疫抑制和免疫亢進(jìn)兩種不同結(jié)果［3－4］?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的免疫抑制模型的建立方法，有一次性大劑量(100或150 mg/kg)注射 Cy［5－7］和多次小劑量(20、40 mg/kg 或 80 mg/kg)給藥［8－11］兩種方式，但藥物的使用劑量和次數(shù)也各有差異。Cy不同劑量和給藥方式對(duì)機(jī)體的免疫指標(biāo)影響到底如何，未見有系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過不同的給藥時(shí)間和劑量比較，建立大鼠的免疫抑制和免疫亢進(jìn)模型，并通過對(duì)第7天和第15天大鼠的免疫學(xué)和血液學(xué)指標(biāo)的分析，確定建立大鼠免疫模型的最佳劑量和給藥方式，為臨床藥物篩選動(dòng)物模型建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

注射用環(huán)磷酰胺，美國(guó)Baxter公司，購(gòu)于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院;RPMI－1640培養(yǎng)基(Gibco);ConA，Sigma公司產(chǎn)品;雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)，Solarbio 公司產(chǎn)品;CCK－8 日本同仁;YAC－1細(xì)胞(ATCC，B04005，購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司);大鼠OVA－sIgG抗體檢測(cè)試劑盒，卡爾文生物科技進(jìn)口分裝試劑盒;Drewe大鼠IL－6預(yù)包被ELISA檢測(cè)試劑盒;Drewe大鼠 TNF－α預(yù)包被ELISA檢測(cè)試劑盒。

1.2 儀器

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(FC 型，Thermo)，BC－2800Vet Mindray血液全自動(dòng)分析。

1.3 動(dòng)物分組與處理

SPF級(jí)SD大鼠64只，體重(120±20)g，雌雄不拘，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(豫)2010－0002】，實(shí)驗(yàn)于河南省中醫(yī)學(xué)院進(jìn)行【SYXK(豫)2010－0001】，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為A、B、C三組，A 組為對(duì)照組，B組又分為B1、B2、B3三個(gè)小組，C組分為C1、C2、C3、C4四個(gè)小組，每組各8只。各組均腹腔注射10%OVA 1 mL進(jìn)行免疫。B組在注射OVA后6 h腹腔注射Cy，各組劑量分別為:B1組125 mg/kg，一次注射;B2組100 mg/kg，一次注射;B3組每日40 mg/kg，每天一次連續(xù)3 d。C組在免疫OVA前3 d腹腔注射Cy，每日劑量分別為:C1組225 mg/kg;C2組80 mg/kg;C3組20 mg/kg;C4組5 mg/kg，連續(xù)3d。對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.4 血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

OVA免疫后第7天和第15天大鼠尾靜脈采血，血液全自動(dòng)分析儀對(duì)大鼠血液進(jìn)行分析。

1.5 免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 免疫器官指數(shù)的測(cè)定

SD大鼠OVA免疫后第7天和第15天各組分別處死4只，取脾臟和胸腺，剔除脂肪，稱重，按公式計(jì)算免疫器官指數(shù):免疫器官指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.5.2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

免疫后第7天和第15天處死大鼠后，無菌取脾臟，PBS洗兩遍，后置于含有5mL PBS的滅菌平皿中，在200目不銹鋼網(wǎng)上研磨并過篩制成單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液于滅菌離心管中，1200 r/min離心6min，棄上清。加入10倍體積的 Tris－NH4Cl，混勻，并于37℃放置5 min，使紅細(xì)胞充分裂解后，1200 r/min離心6 min，棄上清。用PBS洗細(xì)胞兩次后，用含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液洗細(xì)胞一次，然后用1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL。將上述細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔200 μL，每組6個(gè)重復(fù)，同時(shí)每孔加入20 μL ConA，使其終濃度為5μg/mL。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前3 h，每孔加CCK－8試劑20 μL，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A450nm吸光度。

1.5.3 NK細(xì)胞活性檢測(cè)

淋巴細(xì)胞懸液的制備同1.5.2，制備的淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞;取培養(yǎng)24h并處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的YAC－1細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用1640完全培養(yǎng)液洗細(xì)胞兩次，0.5%臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)細(xì)胞活性大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度，使其與效應(yīng)細(xì)胞比值為1∶20。96孔板每孔加效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μL，同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和靶細(xì)胞對(duì)照孔，每組6個(gè)重復(fù)，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，每孔加 CCK－8 試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A450nm吸光度。NK細(xì)胞活性計(jì)算公式:NK細(xì)胞活性%=［1－(A實(shí)驗(yàn)孔 －A效應(yīng)孔)/A靶細(xì)胞］×100%

1.5.4 OVA抗體檢測(cè)(ELISA法)

免疫后第7天和第15天，大鼠眼球采血，37℃溫箱至血清析出，2500 r/min，離心10 min后小心抽取上清液，按試劑盒說明檢測(cè)各組血清OVA抗體水平。

1.5.5 IL－6和TNF－含量的檢測(cè)(ELISA法)

免疫后第7天和第15天，大鼠眼球采血，分離血清，按試劑盒說明檢測(cè)各組血清IL－6和TNF－α含量。

1.5.6 各組免疫指標(biāo)綜合得分

檢測(cè)的免疫指標(biāo)顯著高于對(duì)照組按1分計(jì)算，顯著低于對(duì)照組按－1分計(jì)算，與對(duì)照組差異不顯著按0分計(jì)算，各指標(biāo)得分相加為各組的免疫指標(biāo)綜合得分。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同處理Cy對(duì)大鼠免疫器官指數(shù)的影響

B組(免疫OVA后當(dāng)天注射不同劑量Cy)與對(duì)照組相比，在第7天，大鼠脾臟和胸腺指數(shù)均顯著降低;第15天，脾臟指數(shù)又顯著升高，胸腺指數(shù)各組差異無顯著性。

C組(免疫OVA前3d注射不同劑量Cy)與對(duì)照組相比，第7天，C2和C3兩組脾臟指數(shù)明顯升高，而C2組胸腺指數(shù)卻明顯下降，C1組脾臟和胸腺指數(shù)顯著降低;第15天，C1和C4組脾臟指數(shù)明顯增高，而胸腺指數(shù)明顯降低。結(jié)果見表1。

2.2 不同處理Cy對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

B組(免疫OVA后當(dāng)天注射不同劑量Cy組)與對(duì)照組相比，在第7天，大鼠外周血白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)數(shù)量顯著下降，紅細(xì)胞數(shù)量無差異;第15天B3組白細(xì)胞數(shù)量顯著增多，B1和B2組白細(xì)胞數(shù)目恢復(fù)正常，血小板數(shù)目各組明顯升高，紅細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

C組(免疫OVA前3d注射Cy)與對(duì)照組相比，在第7天，C2和C4組白細(xì)胞數(shù)和血小板數(shù)量明顯升高，各組紅細(xì)胞數(shù)均有升高趨勢(shì);第15天各組白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)均恢復(fù)正常，血小板數(shù)，除C3組外均顯著高于對(duì)照組。結(jié)果見表2。

表1 不同Cy處理對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響()Tab.1 Effect of different cyclophosphamide treatment on the rat organ indexes()

表1 不同Cy處理對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響()Tab.1 Effect of different cyclophosphamide treatment on the rat organ indexes()

注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異無顯著性(P＞0.05)，肩標(biāo)不同字母表示差異有顯著性(P＜0.05)。下同。Note.The same letters in the same row mean no significant difference(P＞0.05)，different letters mean significant difference(P＜0.05).The same as below.

組別 免疫后第7天Groups胸腺指數(shù)Thymus index A 3.54±0.55b 3.12±0.35A 2.49±0.21a 3.14±0.74A B1 1.49±0.20a 1.47±0.34BC 6.24±0.83b 2.55±0.33AB B2 1.89±0.74a 1.49±0.26BC 6.39±1.18b 2.72±0.31AB B3 1.67±0.148a 0.67±0.09D 7.75±0.68c 2.81±0.11AB C1 1.97±0.37a 0.72±0.11D 4.91±1.16d 2.32±0.40B C2 6.75±0.33d 2.04±0.23B 2.93±0.15a 2.92±0.30AB C3 4.49±0.14c 3.21±0.57A 2.51±0.16a 2.93±0.33AB C4 3.62±0.47b 3.16±0.77A 7.75±0.68c 2.35±0.157days after immunization 免疫后第15天15 days after immunization脾臟指數(shù)Spleen index胸腺指數(shù)Thymus index脾臟指數(shù)Spleen index B

表2 不同Cy處理對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響()Tab.2 Effect of different cyclophosphamide treatments on the rat hematologic indexes()

表2 不同Cy處理對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響()Tab.2 Effect of different cyclophosphamide treatments on the rat hematologic indexes()

注:*表示同列數(shù)據(jù)中與對(duì)照組(A)相比，差異有顯著性(P＜0.05)，下同。Note.*means significant difference(P＜0.05)compared with the control group(A)in the same row.

組別 免疫后第7天Groups 7days after immunization 免疫后第15天15 days after immunization WBC(109/L) RBC(1012/L) PLT(109/L) WBC(109/L) RBC(1012/L) PLT(109/L)A 4.80±0.85b 3.69±0.27BC 414.75±108.10 11.30±0.79a 5.32±0.44AB 590.25±56.05 B1 0.28±0.15a 3.14±0.12AB 67.25±12.53* 12.60±1.84a 2.41±0.45D 1615.50±54.45*B2 0.30±0.082a 4.05±0.98CD 96.33±7.51* 10.00±0.85a 4.60±0.32B 1224.67±75.87*B3 0.87±0.15a 4.4±0.30CD 140.00±24.04* 27.93±10.34b 3.40±0.75C 870.00±203.58*C1 0.88±0.94a 2.52±0.49A 38.00±11.43* 18.10±5.17a 4.27±0.72BC 1349.67±236.58*C2 12±2.10d 3.95±0.45BCD 667.33±214.65* 10.47±1.40a 5.89±0.26A 1062.33±195.15*C3 6.27±1.92bc 4.73±0.45D 286.67±55.08 11.63±1.46a 5.25±0.89AB 825.00±63.51 C4 7.23±1.19c 5.75±0.24E 547.67±74.65* 11.67±0.90a 6.31±0.72A 955.67±172.26*

2.3 不同處理Cy對(duì)大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

B組(免疫OVA后當(dāng)天注射不同劑量Cy組)與對(duì)照組相比，在第7天，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力無差異;第15天，B1組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著低于對(duì)照組，而B2組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著高于對(duì)照組。

C組(免疫OVA前3d注射Cy)與對(duì)照組相比，在第7天，C2組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著升高，其他各組差異不顯著;第15天，C2組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著下降，C1和C3組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著升高。結(jié)果見表3。

2.4 不同處理Cy對(duì)大鼠NK細(xì)胞活性的影響

B組(免疫OVA后當(dāng)天注射不同劑量Cy組)與對(duì)照組相比，在第7天，B1、B2、B3組NK細(xì)胞活性均降低，但差異無顯著性;在第15天，B1、B2、B3各組NK細(xì)胞活性均顯著升高。C組(免疫OVA前3d注射Cy)與對(duì)照組相比，在第7天，C3組的NK細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組，然而C1組顯著低于對(duì)照組，在第15天，C1組NK細(xì)胞活性較對(duì)照組升高，C2、C3和C4組NK細(xì)胞活性與對(duì)照組相比變化不大。結(jié)果見表3。

2.5 不同處理Cy對(duì)大鼠OVA抗體生成的影響

與對(duì)照組相比，第7天，C3和C4兩組抗體水平顯著高于對(duì)照組，其余各處理組差異無顯著性;第15天，C1組抗體水平顯著低于對(duì)照組，其他各組抗體水平雖都低于對(duì)照組，但差異無顯著性。B組與對(duì)照組無差異，結(jié)果見表3。

2.6 不同處理Cy對(duì)大鼠IL-6生成的影響

B組(免疫OVA后當(dāng)天注射不同劑量Cy組)與對(duì)照組相比，在第7天，各組大鼠血清IL－6的含量降低，B1、B2組差異有顯著性;第15天時(shí)，各組雖仍低于對(duì)照組，但有恢復(fù)趨勢(shì)，B2組差異有顯著性。

C組(免疫OVA前3d注射Cy)與對(duì)照組相比，第7天，C1組IL－6含量顯著低于對(duì)照組;第15天，B2組顯著降低，其余各組IL－6含量差異均不顯著。結(jié)果見表4。

表3 不同Cy處理對(duì)大鼠免疫功能的影響()Tab.3 Effect of different cyclophosphamide treatments on the rat immune function()

表3 不同Cy處理對(duì)大鼠免疫功能的影響()Tab.3 Effect of different cyclophosphamide treatments on the rat immune function()

免疫后第7天7 d after immunization 免疫后15天15 d after immunization組別Groups抗體IgG/ng/mL Levels of IgG antibody A 0.20±0.018AB 31.58±0.78bc 429.25±13.78 0.23±0.004C 35.10±2.01ab 301.43±7.07 B1 0.18±0.049A 26.71±0.58ab 509.00±7.07 0.19±0.014AB 50.72±8.93cd 279.52±13.09 B2 0.19±0.005AB 28.08±1.28b 526.17±7.25 0.30±0.023D 48.38±9.11cd 268.93±29.80 B3 0.18±0.008A 26.93±0.96ab 429.83±154.07 0.21±0.020BC 52.19±3.32d 264.46±19.95 C1 0.16±0.061A 21.02±3.12a 543.83±67.78 0.45±0.039F 53.96±6.04d 249.05±33.60*C2 0.28±0.008C 37.44±6.61cd 491.17±39.03 0.15±0.030A 26.27±6.45a 260.60±16.54 C3 0.20±0.004AB 39.59±1.42d 616.75±85.21* 0.34±0.038E 28.62±1.82a 257.62±21.45 C4 0.23±0.01B 37.05±4.56cd 593.33±39.12* 0.25±0.046C 39.80±0.68bc淋巴細(xì)胞(A450)Lymphocyte proliferation NK細(xì)胞/%Activity of the NK cells抗體IgG/ng/mL Levels of IgG antibody淋巴細(xì)胞(A450)Lymphocyte proliferation NK細(xì)胞/%Activity of the NK cells 284.88±13.77

表4 不同處理環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠血清細(xì)胞因子含量的影響(，pg/mL)Tab.4 Effect of different cyclophosphsamide treatments on levels of serum cytokines in the rats(，pg/mL)

表4 不同處理環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠血清細(xì)胞因子含量的影響(，pg/mL)Tab.4 Effect of different cyclophosphsamide treatments on levels of serum cytokines in the rats(，pg/mL)

組別521.5±30.69ab 31.6±2.14AB 560.33±26.90a 17.39±2.17A B1 410.67±38.11c 32.05±1.24A 461.7±27.86ab 15.19±1.08A B2 387.30±15.41c 28.29±5.35AB 435.4±16.40b 16.57±1.43A B3 454.00±17.25bc 28.07±0.56AB 492.2±37.05ab 19.43±0.33AB C1 388.00±22.34c 26.07±3.33AB 488.9±12.87ab 16.05±5.39A C2 586.80±34.51a 36.21±2.32B 538.8±66.19ab 23.64±2.32B C3 518.50±60.10ab 29.57±2.93AB 546.8±70.71ab 37.79±1.92C C4 521.10±64.63ab 30.11±2.58AB 511.9±61.52ab 35.43±0.617d after immunization 免疫后第15天15d after immunization IL－6 TNF－α IL－6 TNF－α A Groups 免疫后第7天C

2.7 不同處理Cy對(duì)大鼠TNF-α生成的影響

與對(duì)照組相比，在第7天各組TNF－α的含量差異無顯著性。第15天，B組(免疫OVA后當(dāng)天注射不同劑量Cy組)與對(duì)照組相比差異均無顯著性，C組(免疫OVA前3 d注射Cy)與對(duì)照組相比，C2、C3、C4組均顯著升高，C1組差異無顯著性。結(jié)果見表4。

2.8 各組免疫指標(biāo)綜合得分

各實(shí)驗(yàn)組免疫指標(biāo)得分見表5。B1、B2和B3組免疫指標(biāo)綜合得分，7 d分別為 －4、－4、－4，15 d分別為1、1、2;C1、C2、C3 和 C4 組免疫指標(biāo)綜合得分，7 d分別為 －4、3、5、4，15 d 分別為2、1、2、2。

表5 不同處理Cy組大鼠各免疫指標(biāo)綜合得分Tab.5 The composite scores of all immune indexes in the rats treated by different doses of cyclophosphamide

3 討論

3.1 Cy對(duì)大鼠免疫器官的影響

免疫器官是淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞發(fā)生、分化、成熟、定居和增殖以及產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，其中胸腺是機(jī)體的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所。脾臟是最大的外周免疫器官，受抗原刺激后，參與機(jī)體細(xì)胞和體液免疫的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量增生，致脾濾泡增大，脾體積增大;而受到免疫抑制影響時(shí)，淋巴組織萎縮，致脾體積縮小。因此免疫器官指數(shù)說明了免疫器官的發(fā)育狀況，間接體現(xiàn)了機(jī)體的免疫狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫后當(dāng)天注射不同劑量Cy或者多次小劑量注射Cy(B組)，以及免疫前3 d超大劑量注射Cy(C1組)在免疫后第7天，均能顯著抑制大鼠脾臟指數(shù)，但其抑制作用，在15 d時(shí)消失，脾臟指數(shù)出現(xiàn)代償性增高。免疫前3 d注射適當(dāng)劑量(80、20 mg/kg)Cy(C2、C3組)時(shí)均能引起大鼠脾臟指數(shù)的升高，但維持時(shí)間較短暫，在免疫后兩周基本上消失，進(jìn)入機(jī)體的代償期。對(duì)于胸腺指數(shù)，除了免疫前3 d超大劑量注射Cy(C1組)在7、15 d能顯著影響胸腺指數(shù)外，其他各組差異不大。

3.2 Cy對(duì)大鼠淋巴細(xì)胞的影響

淋巴細(xì)胞根據(jù)表型和功能的不同可以分為很多群體，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞等等。其中T淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)PHA或ConA刺激后，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化情況，可反應(yīng)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平［12］。NK細(xì)胞介導(dǎo)天然的免疫應(yīng)答，它無需抗原或有絲分裂原刺激，也無需抗體或補(bǔ)體參與，即可殺傷腫瘤細(xì)胞或溶解被病毒和胞內(nèi)寄生菌感染的細(xì)胞，在抗腫瘤和早期抗感染過程中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫OVA后當(dāng)天注射不同劑量的Cy或者免疫前3 d超大劑量注射Cy第7天對(duì)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化無影響，但大鼠NK細(xì)胞活性有下降趨勢(shì)而且在第15天NK細(xì)胞活性明顯增強(qiáng);而免疫前3 d一次注射80 mg/kg Cy第7天能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，一次注射20 mg/kg Cy第7天能促進(jìn)NK細(xì)胞活性。說明Cy對(duì)大鼠淋巴細(xì)胞的活性有影響，但其影響作用與Cy劑量和作用時(shí)間相關(guān)。

3.3 Cy對(duì)大鼠體液免疫的影響

體液免疫是機(jī)體特異性免疫的一個(gè)重要組成部分，血清抗體的高低在一定程度上反映機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力，也即抗體效價(jià)的高低一定程度上能反映機(jī)體免疫狀態(tài)。已有文獻(xiàn)報(bào)道Cy對(duì)體液免疫呈現(xiàn)小劑量促進(jìn)和大劑量抑制的雙向作用［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Cy大劑量(總劑量在100～125 mg/kg)對(duì)大鼠抗體生成的影響在15d內(nèi)不明顯;225 mg/kg在15 d時(shí)可抑制抗體產(chǎn)生;注射較低劑量的Cy(總劑量15、20 mg/kg)對(duì)抗體生成在第7天時(shí)有一定的促進(jìn)作用。說明Cy對(duì)體液免疫確實(shí)有雙向調(diào)節(jié)作用，其作用與劑量密切相關(guān)，但作用持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)。

3.4 Cy對(duì)大鼠IL-6和TNF-α的影響

多種淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些非淋巴細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等均能產(chǎn)生細(xì)胞因子IL－6，IL－6對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化都有調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化和增生，輔助B淋巴細(xì)胞促使抗體合成和分泌，參與體液免疫過程。TNF－α主要是由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子，在許多生理的免疫應(yīng)答中有重要作用。研究表明促炎因子IL－6和TNF－α與一些自身免疫性疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人可在滑膜和血清中檢測(cè)到高水平表達(dá)的IL－6［13］，銀屑病病損局部和血清中IL－6和TNF－α水平均見升高［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大劑量注射Cy(總劑量100～225 mg/kg)能顯著抑制大鼠血清IL－6的含量，但作用時(shí)間有限，而免疫前3 d注射Cy(總劑量在15、20或者80 mg/kg)能顯著提高TNF－α的含量。

3.5 Cy對(duì)大鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的劑量與時(shí)效

有文獻(xiàn)報(bào)道用低劑量(20、80 mg/kg)多次腹腔注射的方式建立免疫抑制模型［8，15－16］，我們?cè)谇捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)(分別以125、100 mg/kg的劑量腹腔一次注射，以每日80、40 mg/kg劑量連續(xù)3 d腹腔注射)發(fā)現(xiàn)，以每日80 mg/kg的劑量連續(xù)3 d腹腔注射大鼠，從免疫后第12天開始大鼠出現(xiàn)不同程度的死亡，可能由于抑制作用過強(qiáng)超出了大鼠自身的調(diào)節(jié)范圍。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cy不同劑量、使用次數(shù)對(duì)機(jī)體的免疫功能會(huì)有影響，且其影響持續(xù)時(shí)間有限，在使用Cy建立免疫抑制或免疫亢進(jìn)模型時(shí)，應(yīng)綜合考慮各項(xiàng)免疫指標(biāo)和其作用時(shí)效。免疫抑制模型可選用B1、B2模型，即注射OVA后6 h腹腔一次性注射Cy(125 mg/kg或100 mg/kg)，兩組模型免疫指標(biāo)綜合得分一樣。免疫亢進(jìn)模型，實(shí)驗(yàn)周期7 d以內(nèi)，C3、C4模型均可(即免疫OVA前3 d腹腔一次性注射Cy劑量20 mg/kg或每日5 mg/kg，連續(xù)3 d)，C3要更好些;實(shí)驗(yàn)周期大于7 d小于15 d，C3組模型更合適(即Cy劑量20 mg/kg)。

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